Metody pro laboratorní diagnostiky chlamydiové infekce v čelistní zánět vedlejších nosních dutin

Video: Otolaryngolog Ponidelko SN (SM Clinic)

I. Tsitoskopichesky způsob detekce Chlamydia

Navrhla dvě metody, které mohou být rozděleny do invazivní a neinvazivní. Podstata První z nich je, že materiál pro tuto studii je obsah čelistních dutin, což má za následek vpichu jehly Kulikovskii který po odstředění byl použit pro přípravu šmouhy.

Druhá metoda je následující: po nosní anemizatsii 0,1% epinefrin řešení a aplikace anestezii střední oblasti nosní průchod dikaina 3% roztok - 0,3 ml, s použitím speciálních jedno kartáče prováděné plot materiál při otočných pohybech mezi 10-15 mediální povrch středního skořepy a laterální nosní stěny v oblasti vedlejších nosních dutin anastomózy. Takto získaný materiál se rovnoměrně na podložní sklíčko, na vzduchu se vysuší a fixovány v acetonu po dobu 10 minut při teplotě 4-6 ° C, Připravené tampony mohou být uloženy až do studie po dobu 2 týdnů. při teplotě 2-6 ° C,

Malování na Romanovský-Giemsa. Ex tempore barvivo se zředí destilovanou vodou 1:10. Sklíčka se umístí do Petriho misky na dřevěných holí drog dolů. Prostor mezi mrtvice a spodní části poháru je naplněn barvivem. Barvení se provádí po dobu 45 minut. Poté se sklo důkladně promyje tekoucí vodou, vysuší se filtrační papír a diferenciaci v okyseleném alkoholu (100 ml 96% ethanolu se přidá 10 kapek ledové kyseliny octové). Po barvení přípravky jsou při pohledu ve světelném mikroskopu s použitím ponorného čočky (X90). V tomto případě se buňky cytoplasma zbarvené modře, jádra - v fialovomodrém cytoplazmatické inkluze chlamydie jsou určeny jako tmavě modré nebo růžové mikrokolonií na pozadí modré cytoplazmy. V kroku elementární tělíska Chlamydia vměstků zbarveny růžové krok výchozích buněk modře (Ponidelko SN, 2001). Pro zvýšení obsahu informace o způsobu morfologických studií provedených v počítání počtu neutrofilů, lymfocytů a makrofágů v nátěrech připravených před ošetřením a dynamiky pod vlivem podávaných léků.

II. Metoda přímé imunofluorescence

Skvrny připravené z soskobnyh materiálů, stejně jako krevní nátěry barveny směsí přijatého v pracovních ředěních polyvalentní imunoglobulin fluorescenční chlamydiových a hovězího albuminu, označených rhodaminem na kontrastní pozadí. Pomocí pracovní ředění séra 1 / 20-1 / 40. Sklíčka se zkušebního materiálu a umístěné barvivo se umístí do vlhké komory v termostatu po dobu 30 minut, načež se sklo se odstraní a promyje extenzivně ve fosfátem pufrovaném fyziologickém roztoku (pH 7,2) za míchání magnetickým míchadlem po dobu 1 hodiny, změna pufru po 30 minut. Na sušených nátěrech použita jedna kapka pufru s glycerolem (9 ml glycerolu a 1 ml fosfátem pufrovaného fyziologického roztoku), a pak se na ně vztahují s krycím sklem (Ponidelko SN, 2001). Přípravy jsou prohlížení pod fluorescenčním mikroskopem „LUMAM-OUT“. Analýza ziskovosti se provádí vizuálně. Získané výsledky jsou považovány za pozitivní, pokud je v přípravku zjištěny morfologicky typické chlamydií prvky specifické fluorescenční smaragdově zelené nebo žlutozelené:

Chlamydia retikulocyty (PT) a klastru chlamydie v cytoplazmě ve formě mikrokolonií, které mají podobu kompaktní, difuzně barvených útvary různých velikostí - od 0,25 do 1,5 mikrometrů;
Chlamydia elementární tělíska (EBS), - tvorba, které jsou především u buněk, kulovité nebo vejčitého tvaru s výrazným barevným obvodového lemu ve formě uzavřeného kruhu, nebo semiring velikost 0,25-0,5 mm;
intercellularly nachází inkluze - velké jasně zelené skvrny vytvořené jsou blízko u sebe ET.

III. sérologické metody

objem krve v 2,5-3,0 ml v nalačno odebraných z loketní žíly do suché centrifugační zkumavky. Trubice s krví, aby se lépe sraženiny zatahování krvinek inkubovaly při teplotě 37 ° C po dobu 40-45 minut. Po inkubaci zkumavka se odstřeďuje 20 minut při 3000 ot. / Min sraženina „obklíčit“, a zkumavka se umístí na 1 hodinu do chladničky a potom, za použití Pasteurovy pipety, sérum bylo odděleno od sraženiny. Séra byly transportovány do laboratoře, v příštích 1,5-2 hodin nebo skladovány při 4-6 ° C po dobu 1-3 dnů. Jednotlivé vzorky séra obsahují přípustné v mrazáku chladničky při teplotě minus 20 až 40 ° C až do sériové studií období, které není delší než 6 měsíců.

Nejkonkrétnější a informativní (90%), je považován za reakce nepřímou imunofluorescencí (RNIF). Detekce protilátek proti chlamydie pouze jeden vzorek séra, i když jejich výkon titr 1 / 8-1 / 16 může znamenat pravděpodobnost proudu jako chlamydiovou infekci a přítomnost stopového reakce související s jakoukoli chlamydiové onemocnění etiologie migrované poslední. Zvýšení chlamydiové titry protilátek 1 / 64-1 / 256 a dokonce ještě vyšší v jediném vzorku séra na aktuální dlouhých a složitých forem infekce odráží nahromadění limit mikroorganismus humorální odpověď a odpovídající výsledky klinické a epidemiologické analýzy a anamnestických údajů nabývající diagnostickou hodnotu.

Nepřímá imunofluorescence technika umožňuje identifikaci Chlamydia tvořit s vhodnými testovaných objektů a titrace séra s ohledem na specifické typy látek, také umožňuje vyhodnotit obsah séra jednotlivých tříd imunoglobulinů v přítomnosti komerční fluorescenční Ig M, A, G. negativní výsledky sérologických testů nevylučuje přítomnost akutní nebo chronické (trvalé) chlamydiovou infekci (Ponidelko SN, 2001).

Použití RNIF maxilární sinusitida u pacientů určení titru Chlamydia protilátek v séru. Jak se používá antigenní přípravky připravené na nátěrech ohraničený sklíček mikrobiálních suspenzí pevných po dobu 30 minut se studeným acetonem. Materiál pro stěru suspenze jsou směsí žloutkového váčku z kuřecích embryí nebo orgánů bílých myší infikovaných C. trachomatis, C. pneumoniae a C. psittaci.

Tyto antigenní prostředky, které mají specifitu k úrovni rodu, poskytují identifikaci Chlamydia protilátek (AT) epidemiologicky významných pro všechny typy chlamydie. Test sérum v ředění 1: 2 až 1: 256 se aplikuje na tampony, skla, umístí do vlhké komory a inkubuje se při teplotě 37 ° C po dobu 15-20 min. Po expozici se zkušební materiál se promyje vodou z vodovodu a poté se sklo ponoří do šálku baterie s fyziologickým roztokem pufrovaným fosforečnanem o pH 7,2-7,4, a pak se opláchne destilovanou vodou. Po vysušení při teplotě místnosti, čímž se způsobí šmouhy přijatá na pracovním ředění králičího anti-lidského imunoglobulinu luminiscenční a umístění skla ve vlhké komoře, inkubují se při teplotě 37 ° C po dobu 15-20 min. barvení směs se potom odstraní, sklo se promyje fyziologickým roztokem pufrovaným fosfátem pH 7,2-7,4 po dobu 10 minut, promyje se destilovanou vodou a vysuší se na vzduchu.

Mikroskopie barvených přípravků provádí pomocí fluorescenčního mikroskopu. Intenzita fluorescence specifické ve formulacích byla vyhodnocena konvenční chetyrehkrestovoy stupnice (Ponidelko SN, 2001):

„++++“ - jasně fluorescenční zelenkavá kolem EBS jasně viditelných světelných „ráfky“;

„+++“ - dostatečně jasné fluorescenční žluto-zelené barvy, je možné detekovat periferní „ráfky“ v ET;

„++“ - slabá fluorescence, patogen morfologicky ukázalo zcela jasně, ale periferní „ráfky“ v ET sotva znatelné;

„+“ - slabá fluorescence, barevné nedefinované morfologie mikroskopie objekt rozpoznatelný špatné.

Pro diagnosticky-významný titr anti-Chlamydia protilátky se maximální ředění séra, který poskytuje specifický obraz, která není nižší než „++“. Při hodnocení sera serologickou aktivitu proti chlamydiové antigeny pro příjem diagnosticky významné titry 1: 8 a vyšší.

IV. Metoda polymerázové řetězové reakce

Polymerázová řetězová reakce (PCR) byla poprvé popsána v roce 1985 a stal se standardní metoda amplifikace DNA v mnoha laboratořích molekulární biologie. Základem techniky oligonukleotidů namířených opakující se cykly syntézy DNA, což vede k replikaci in vitro cílové nukleotidové sekvence. V důsledku toho může dojít k zesílení 1 miliardu kopií cílové DNA, které mohou být detekovány buď gelovou elektroforézou nebo hybridizací se specifickou sondou, následuje detekce hybridů testem ELISA (ELISA). PCR má vysokou druhovou specifičnost a citlivost na 10 molekul DNA (Ponidelko SN, 2001).

Po odebrání materiálu v souladu s výše uvedenými postupy s použitím speciálních kartáčů na jedno použití se umístí do sterilních zkumavek, 2 ml (epindorfy) předem připraven v pufru (0,9% roztok chloridu sodného). Materiál po dobu 2 hodin a dopraveny do laboratoře po zmrazení na teplotu -18 ° C se udržuje po dlouhou dobu před studií.

Výsledek analýzy se považuje za pozitivní, jestliže:

Velikost DNA produkt v klinickém vzorku, přesně odpovídá DNA produktu z kontrolního vzorku;
ve vzorku, který obsahuje klinického vzorku a vnitřní standard, je identifikován specifickým DNA produktu vnitřního standardu;
ve vzorku, který obsahuje vodu (negativní kontrola) namísto klinického vzorku DNA produkt detekován.

Výsledek analýzy se považuje za negativní, pokud:

ve vzorku, který obsahuje klinický vzorek, specifických produktů DNA nemůže být detekovány;
PCR za následek obou kontrolních vzorků specifické produkty DNA nerozpoznává.

Analýza byla opakována, pokud:

ve vzorku, který obsahuje kontrolní DNA, produkty DNA specifické nemohou být detekovány;
ve vzorku s DNA produkty vnitřních standardů specifických nemohou být detekovány, a detekovat specifické DNA produktu v negativní kontrole.

V. kultivační metoda pro izolaci chlamydií

Izolace patogenu v buněčných kulturách (cm), předem ošetřeny různými antimetabolity, je jedním z nejlepších metod pro chlamydie diagnózu, tak zvané „zlatý standard“.

Materiál je přijata jako metoda přímé imunofluorescence (PIF), sterilních speciálních kartáčů. Přijatá materiál je umístěn v dopravním médiu. Vzhledem k tomu, transportní médium je fosfátový pufr s sacharózy, ke které je před použitím tepelně inaktivovaného hovězího séra přidá při teplotě 4% z celkového počtu, streptomycin 50 ug / ml amfotericinu B 25 mg / ml média. Dodávky materiálu v laboratoři se provádí (v termosce s ledem) nejpozději za 2 hodiny po odběru vzorků. Kultury provádí za použití buněčné kultury LLC + MR2 + L929 + BHK-21C uměle nízký odpor. Vyzvednutí materiál je laminován na monovrstvách buněčných kulturách, pěstovaných na krycí sklíčka, předtím vypuštěný růstové médium. Poté, infikované buněčné kultury se umístí do lahviček a centrifuguje po dobu 1 h při 3000 ot. / Min, což zvyšuje počet intracelulárních inkluzí. Po odstředění se materiál nalil do vialek, přidat izolační médium „jehly» (Eaglas MEM) s tsiklogeksamidom v koncentraci 2 mg / ml. Zkumavky byly inkubovány v termostatu při 37 ° C po dobu 48-72 hodin (odpovídá době cyklu chlamydie), načež se krycí sklíčka byly odstraněny z monovrstvy s trubkami, které na skleněná sklíčka se monovrstva v kanadském balzámu a stanovení začlenění patogen. Předtím, fixaci a barvení se provádí šmouhy flyuorestsiiruyuschimi protilátek a výsledky hodnoceny po 48-72 hodinách PIF (s použitím specifických polyklonálních a monoklonálních protilátek). Po obdržení negativních výsledků produkovat nové semeno (průchod) materiálu. Infekce buněčné monovrstvy a vyhodnocení výsledků se provede standardními metodami.

Způsob diagnostického přidělování chlamydií v buněčné kultuře se musí používat po celou dobu onemocnění, s výjimkou období antibiotické léčby a po dobu 2-3 měsíců. po ní. Pro kontrolu léku za účelem identifikace životaschopné chlamydie, které mohou vykonávat svůj celý životní cyklus, tato metoda se používá po 3 měsících. po ukončení léčby.

VI. Způsob elektronová mikroskopie

Za účelem vytvoření diagnostického přetrvávající chlamydiové infekce v čelistní způsobem zánět vedlejších nosních dutin za použití elektronové mikroskopie. Studie bioptického nosní sliznice a dutiny. Za tímto účelem, slizniční části ihned po plotu jsou fixovány v 2,5% glutaraldehydu tého 0,1 molární kakodylátovém pufru při pH 7,4 po dobu 2-24 hodin. Po promytí třikrát v kakodylátovém pufru dofiksiruyutsya 1% roztok oxidu osmičelého na 1,5-2 hodiny. dehydratace se provádí v alkoholech s rostoucí koncentrací léčiva po dobu 15-20 minut a impregnační pryskyřice ve směsi s Epona aralditom. Na závěr se polymerace provádí v inkubátoru po dobu 3 dnů. při 37 ° C a 60 ° C, Po polymerace semithin řezy byly připraveny 1 mikron hustá ultratome LKB-3 (Švédsko). Barvené řezy se provádí podle metody navržené C. D. Humphrey, F. E. Pittman (1974), methylenová modř, azur-2 a základní fuchsinem pro prohlížení a analýzu pomocí světelné mikroskopie (Ponidelko SN, 2001). Současně lze fotografovat pomocí photomicroscope «Opton» (Německo). Pak se připraví ultratenké řezy 3700 angstrómů silné, je umístěn na jejich velikosti mědi ok mezi 200 a potom porovnán s nasyceným 30% roztoku ethanolu a citrátem olovnatým (Reynolds). Řezy byly zkoumány pod elektronovým mikroskopem JEM «100S» (Japonsko) při urychlovacím napětí 80 kV, s nárůstem x5, x10, x50 X30, tisíckrát. Foto použitý typ filmu FT-41P (Rusko).

Pro diagnostiku chlamydiových lézí vedlejších nosních dutin, je nutné použít speciální diagnostického algoritmu.

Základním principem diagnostického vyhledávání je jeho třístupňová.

V první fázi screeningové studie séru pacientů s sinusitidy pro detekci Chlamydia protilátek indikujících probíhající infekce ELISA a RNIF a ověřování chlamydiových druhů (C. pneumoniae, C. trachomatis, C.psittaci).

Ve druhém stupni se pomocí PIF a PCR se provádí přímo v diagnostice chlamydií ložisek (nosní dutiny a vedlejších nosních dutin) a leukocytů z periferní krve ke stanovení generalizované infekce.

Ve třetí fázi diagnózy pomocí CM určit Citlivost na antibiotika činidla.

Tento algoritmus byl testován v průzkumu 97 pacientů, včetně těch s chronickou maxilární sinusitidy představovaly 28 osob, 39 byli pacienti s rekurentní akutní maxilární sinusitidy a 30 - netrpí chorobami horních cest dýchacích a vstoupil do kontrolní skupiny. Srovnávací informativnost různé laboratorní metody pro diagnózu chlamydiové infekce mezi skupinami sledovaných údajů uvedených v tabulce.

Srovnávací informativnost různé laboratorní metody pro diagnózu chlamydiové infekce u zánětu vedlejších nosních dutin

metoda	chlamydiové infekce
metoda	S. pneumoniae	C. trachomatis	C. psittaci	pouze
Podílový fond	59 (60,7%)
PCR	35 (36%)	8 (8,2%)	-	43 (44,3%)
KM	31 (31,9%)	11 (11,3%)	-	42 (43,2%)
RNIF	25 (25,7%)	14 (14,4%)	7 (7,2%)	46 (47,3%)

Jak je patrné z údajů uvedených v materiálu od pacientů s diagnózou anti-chlamydiových protilátek chlamydie polyklonální skupiny pro konkrétní 59 (60,7%) pacientů. Nicméně, použití jiných diagnostických technik nechá za celou dobu jejich identifikaci. Pokud je nastaveno přibližně rovná frekvenci detekce S. pneumoniae a pacientů s infekcí C. trachomatis v materiálech zánět vedlejších nosních dutin (PCR - 44,3% CM - 43,2%, RNIF - 40,2%).

To znamená, že výsledky srovnávací studie metod pro diagnostiku chlamydiové infekce ukázalo vysokou frekvenci detekci Chlamydia s maxilární sinusitidy, který umožňuje definici „Chlamydia etiologie zánětu vedlejších nosních dutin“ a identifikovat celou řadu klinických projevů, charakteristika této skupiny onemocnění.

"Onemocnění, poranění a nádor maxilofaciální"
ed. AK Iordanishvili

Sdílet na sociálních sítích:

Podobné