Transgenní zvířata: technologie

Video: Bioseminars.ru: Egor Malashichev - Transgenní zvířata a srovnávací embryologie

Na rozdíl od rostlin, kde je možnost získání fertilní rostliny z transformované somatických buněk a klonování, produkce transgenních zvířat - velmi obtížné a zdlouhavé.

Strategie použitá je následující:
1. Klonovaný gen se zavede do oplodněného vajíčka jádra.
2. oplodněného vajíčka s exogenní DNA se implantují do recipientní samice (od úspěšného dokončení savčího embrya za jiných okolností nemožné).
3. Odvzdušňovací potomstvo vyvinula z implantovaných vajec, které obsahují klonovaného genu ve všech buňkách.
4. zkosení zvířata, která nesou klonovaného genu v buňkách zárodečné linie a poskytují novou genetickou linii.

Experimenty na geneticky modifikovaných mnohobuněčných organismů od zavedení transgenů do nich vyžadují hodně času. Nicméně, transgenní stát mocným nástrojem pro studium molekulární bází savčí genové exprese a vývoje, vytvoření modelové systémy, umožňuje studium lidských onemocnění, jakož i genetickou modifikaci mléčných žlázách živočišných buněk za vzniku mléčné proteiny, které jsou důležité pro medicínu. Došlo i nový termín „pharming» (pharming), s odkazem na procesu přípravy mléka transgenních zvířat autentické lidské proteiny nebo léčiv.

Použití mléka je výhodné proto, že je vytvořen v těle zvířete v velkém počtu a mohou nadaivat jako potřebná bez poškození zvířete. Produkoval mléčné žlázy a vylučován do mléka není nové bílkoviny musí tedy působit nežádoucí účinky na normálních fyziologických procesů u transgenních zvířat, a podrobeny post-translační změny, která je alespoň v blízkosti těch, v lidských buňkách. Kromě toho jsou jeho izolace z mléka, která obsahuje jiné proteiny, nesmí být příliš obtížné.

Navzdory tomu, že se první transgenní zvíře byly získány v roce 1985 zavedení exogenní DNA do pronukleární zygot dosud vyvinut účinný způsob, který by mohl být použit pro vytvoření geneticky modifikovaných zvířat, bez ohledu na typ a účelu experimentu. Vývoj nových účinných metod genového přenosu do embryonálních a somatických buněk zvířat, jakož i zlepšení stávajících postupů je naléhavým úkolem.

Mezi velkým množstvím způsobů zavedení exogenní DNA do genomu zvířat lze rozlišit, které jsou široce používány v praxi transgenních:
- metoda mikroinjekce,
- retrovirem zprostředkovaný přenos genu,
- modifitsirovanngh využití embryonálních kmenových buněk,
- Převod transformovaných jader generativních a somatických buněk
- Použití spermií a spermatogonií jako vektory DNA.

Mezi další způsoby dodávání exogenní DNA do organismu zvířat, lze poznamenat, použití liposomů, adenovirových vektorů, stejně jako vstřikovací metody vysokorychlostního. Nicméně, tyto metody nejsou široce používány vzhledem k jejich nedostatečné stability a nedostatek integrace transgenu do genomu.

Mikroinjekce rekombinantní DNA do oplodněných oocytů mnohobuněčných živočichů jsou stále nejpopulárnější způsob, jak zavést cizorodých genů do zvířat. Navzdory skutečnosti, že tato metoda vyžaduje vysokou zručnost a drahé vybavení, jednoduchost a spolehlivost platí všechny jeho nedostatky.

První a dobře zavedený experimentální systém pro produkci transgenních zvířat byla myš. Dárce samice myší s experimentálním superovulaci pářil se samci z výroby, po 12 hodinách byl izolován oplodněná vajíčka a umístěny v kultuře. Dále, větší ze dvou pronukleů (obvykle muži) byla injikována rekombinantní DNA (obr. 2.17). Survivors injekčně vejce je transplantovány do recipientní samice. Jen pokračoval část transplantovaných oocytů vyvinout až do porodu.

Obr. 2.17. Mikroinjekce exogenní DNA do pronukleu oplodněného vajíčka savců pod mikroskopem (a) a experimentální nastavení (B)

Frekvence integrace exogenní DNA za použití metody mikroinjekce je ovlivněn takovými faktory, jako je čistota injekce vzorku, tvaru a koncentrace DNA, složení roztoku pufru pro mikroinjekce, kvalita embryí, a způsob příjemce přenosu embrya (nechirurgická, chirurgické, laparoskopické).

Transgenní zvířata jsou identifikovány v potomstvu různými způsoby, většina z PCR a spojen se získání transgenních linií. Některé z transgenních zvířat jsou mozaiky (zárodečné buňky neobsahují exogenní DNA) křížením transgenní je tedy menší část první generaci potomků než vypočtená 50%. V některých případech, homozygotní linie nelze získat, protože transgenních inzertů 5-15% homozygotních smrtelné, protože vložení někdy porušuje životně důležité části genomu.

Přesný mechanismus pro integraci injektovaného DNA do chromosomů cílových buněk není známa, ale analýza DNA vložené struktury odhaluje některé body. Integrace dochází náhodně na jednom chromozomálním lokusu, který může obsahovat jeden až několik tisíc tandemových kopií integrované DNA. Přibližně 30% z primárních transgenních zvířat získaných obvykle vykazují určitý stupeň mozaiky, které mohou vyplynout z integrace replikace exogenní DNA po prvním cyklu.

Stupeň integrace exogenní DNA do genomu, tj., počet transgenních zvířat z celkového počtu narozených zvířat s využitím metody mikroinjekce, v závislosti na druhu mění k malému rozsahu 5-15%. Nejdůležitější vzhledem k nákladům potřebné k výrobě jednoho transgenního zvířete je transgenní celkový index účinnosti, který se vypočítá jako poměr získaného transgenního zvířete z celkového počtu transplantovaných embryí, vyjádřený v procentech. Hodnota tohoto indexu pro savce je také relativně konstantní v průměru o ~ 0,5% pro prasata a krávy do asi 2% u myší.

Retrovirové vektory se také používají pro generování transgenních zvířat. Infekce preimplantačních embryí s rekombinantní retroviry - relativně jednoduché a účinné řízení.

Vosmikletochnuyu morula (obr. 2.18) uvolní z vaječné skořápky a umístí se do kultivační misky s fibroblasty produkují rekombinantní retrovirus. Infikované embrya do stadia blastula byly implantovány do falešně samic. V důsledku toho, transgenní organismy jsou generovány, mozaiky v závislosti na počtu a umístění Vestavby rekombinantní DNA do genomu. Z tohoto důvodu, aby se získal čistý řádky dále vyžaduje rozsáhlé outbreeding.

Nevýhodou tohoto způsobu je omezit vložení exogenní DNA ~ 8 spotřebního zboží, přičemž transgen může být bez sousedních regulačních sekvencí nutných pro jeho expresi, a v některých případech, integrovat do původního lokusu nestabilní.

Nové lentivirové vektory (lentiviry patří do rodiny retrovirů), prokázaly svou velmi vysokou účinnost při poskytování DNA do oocytů a zygoty. Injekce rekombinantní lentivirové konstruktů do perivitelline prostoru prasečích zygoty a hovězích oocytů za následek vzhledu potomstva s nejvyšší současné době laloků transgenních zvířat. Ve stejné době, lentivirové vektory mají všechny nevýhody retrovirové: malé velikosti vložení exogenní DNA a roztroušené integrace do hostitelského genomu, což může vést k nežádoucím vedlejším účinkům, jako je aktivace onkogenů a inzerční mutageneze. Kromě toho, lentivirové vektory pro vysoký stupeň mozaiky transgenního potomstva vyrábí a jednotlivé skutečnosti neumlčuje (inaktivaci) rekombinantní lentivirové sekvence získané transgenní linie.

Použití retrovirových vektorů má jednu velkou nevýhodu. I když jsou tyto vektory jsou vytvořeny tak, že jsou replikačně defektní retrovirus kmen genom (helper virus), který je nezbytný pro získání velkého množství DNA vektoru mohou spadat do stejné jádro jako transgenu. Přes všechna opatření, retroviry pomocníci mohou být replikovány v transgenním zvířeti, což je naprosto nepřijatelné, pokud tato zvířata, které mají být použity jako potraviny nebo jako nástroj pro získání komerčního produktu. A protože existují alternativní metody transgeneze, retrovirové vektory jsou zřídka použity pro generování transgenních zvířat, které mají komerční hodnotu.

Obr. 2.18. Schéma pro získání linie transgenních myší s použitím retrovirových vektorů

Modifikované embryonální kmenové buňky mohou být použity pro získání transgenních zvířat. Buňky izolované z myších embryí ve stádiu blastocysty, mohou proliferovat v kultuře, při zachování schopnosti diferencovat se všechny typy buněk, včetně buněk zárodečné linie, při podávání v jiném embrya do stádiu blastocysty (obr. 2.19).

Tyto buňky se nazývají pluripotentní embryonální kmenové buňky (ES). ES-buňky v kultuře mohou zavést transgenu cílové různé techniky (transfekce, elektroporace, retrovirové infekce, atd.), Bez narušení jejich pluripotence. Praktickou výhodou tohoto systému je, že poskytuje velkou příležitost pro výběr buněk určitého parametru. To může být počet kopií transgenu, jeho lokalizace nebo expresních vzorů.

Znalost sekvence obklopující specifické místo pro požadovanou integraci lze zkonstruovat vektor pro vložení cílové DNA pomocí homologní rekombinace. Například nahradit gen kódující snadno identifikovatelné indikaci pro účely výběru odstraněním jeho nebo obnovení funkce ve výsledném transgenní buňky.

Stejným způsobem, tzv knockout myší (knock out) - myši s inaktivovaným směrově specifické buněčného genu pro studium jeho funkci. K provedení homologní rekombinantní vektor je konstruován z fragmentů cílového genu, která je naplánována pro inaktivaci část cílového genu se potom nahradí selekční marker pro selekci buněk, s integrovaným designem.

Obr. 2.19. Příprava transgenních myší rekonstrukcí embryí za použití geneticky modifikovaných embryonální kmenové buňky (ES-buněk). ES-buňky jsou odvozeny z vnitřní buněčné hmoty myší blastocysty

Vybrané transgenní ES-buňky mohou být kultivovány a použity pro produkci transgenních zvířat. Tím se zabrání nechtěnému vložení transgenu, který je charakteristický pro metodu a mikroinjekce retrovirových vektorových systémů.

Všechny získané v rámci systému mozaiky zvířat je tak nutné chovatelské práce pro získání čistých linií. Primární problém mozaiky transgenní zvířata mohou být překonány přesazení jádra transformovaných ES-buněk do enukleovaných oocytů, které byly pak pokračoval v jejich normální vývoj. Výsledkem je, že v každé buňce živočicha získané obsahuje transgen.

Bohužel, pluripotentní ES buňky, podobně jako u myší, dokud se nacházejí v jiných savců a ptáků, ale hledání pokračuje.

Přenosu jádra transformovaných generativní a somatické buňky do vajíčka, nebo somatické nukleární převod (somatické přenos nukleární), jiná metoda používá v praxi transgeneze. Bylo ukázáno, že jádro embryonálních buněk různých zvířat, když je přenesen do enukleovaného vajíčka někdy schopen zajistit vývoj nového organismu. Po krátké kultivaci i jádro některé z diferencovaných buněk, jsou schopny zajistit rozvoj životaschopného jedince.

Například známá ovce Dolly byl klonován v roce 1997 z fúze kultivované (3-6 průchody) epiteliálních buněk (vemeno) dospělé zvíře se šesti rok postrádající vajíčka jádra (obr. 2.20). I když nelze vyloučit možnost, že klonování bylo náhodně užil nediferencované buňky přítomné v donorové epitelu.

Obr. 2.20. Klonování ovcí přenosem jádra. Epiteliálních buněk v kultuře je indukována pro vstup do fáze G0 (stupeň, na kterém vejce). Potom se fúze těchto buněk s enukleovaného oocytu a embrya se pěstují až do časných stadiích embryogeneze. Načež se embrya implantují do dělohy náhradní matky, kde další vývoj probíhá. V experimentu, klonování J. Wilmut (I. Wilmut) byla provedena Dolly 277 m enukleovaného vajíčka s prsu buněk v G0 fázi z 29 přežívajících embryí vyvinut pouze na jeden životaschopných organismů

Dolly Klonování diferencovaného buněčného jádra a ostatní tři ovce z embryonálních buněčných jader mohly provádět přenosem jádra z buněk, které jsou v klidové fázi (G0), a případně charakteristiky zvířat embryogeneze. U ovcí zygot v prvních třech oddílů, v délce několika dní, pouze dojde k replikaci DNA, žádná z genu není exprimován. Předpokládá se, že v průběhu této doby se zavádí DNA se uvolní z buněk specifických regulačních proteinů a odpovídající geny jsou spojeny s embryonálního vývoje embryonální iniciátor proteinových faktorů, z cytoplasmy vajíčka.

Zatímco klonovací technologie jsou stále ještě velmi daleko k dokonalosti - klonoval Dolly odhaluje mnohé známky stárnutí pleti, je to velmi slibná technologie pro výrobu transgenních zvířat. Dokonce i když existují různé problémy s první generace, s největší pravděpodobností, druhá generace nebude mít nevýhody, získaných pomocí „staré“ pro vejce jádra.

Hlavním problémem, který má být vyřešen tak, aby se vytvořily nějaké transgenních zvířat pomocí metody přenosu jádra byla skutečná, - je ochrana pluripotentních buněk se v kontinuální kultuře. V současné době je aktivně vyhledává faktory přeprogramování diferencované buňky k vyvolání pluripotence. Pokud se to podaří, bude genetická modifikace těchto buněk a vytvoření transgenních organismů somatickou přenosem jádra se téměř rutinní postup, a zároveň se jedná o izolované úspěšné pokusy.

Umělé chromozomy jako transgen vektoru. Většina transgeny jsou cDNA malé geny (<20 тнп) или фрагменты генов. Зачастую кДНК плохо экспрессируются в клетках млекопитающих, а когда трансгеном служит геномная ДНК, важные геноспецифичные регуляторные последовательности, расположенные до и после гена-мишени, обычно не входят в состав вставки. Кроме того, полноразмерные гены и мультигенные комплексы (>100 тнп) слишком велики для встраивания в обычные векторы.

Vzhledem k tomu, to všechno, je použití oceli pro transgenní kvasinkového umělého chromozomu (YAC), uzavírající fragmentů genomové DNA délky 100 až > 1000 spotřebního zboží a umělé chromozomy ještě větší kapacity (asi umělých chromozomů). Tyto episomální vektory mají další výhodu - vyhnout se poloha efekt genovou expresi, když je exogenní DNA. Hladina exprese vloženého genu je silně závislá na jeho chromozomální poloze, například, vkládání neaktivní chromatin (heterochromatin) neporušené chromozomu vede ke genu inaktivaci.

Použití umělých kvasinkových chromozomů (YAC), nesoucí několik příbuzných genů nebo velké gen, transgenní myši byly vytvořeny mikroinjekci do pronukleu oplodněného vajíčka nebo transfekcí ES buněk. Transgenní myši nesoucí shluk pěti funkční lidský globin genovv celkové délce asi 250 spotřebního zboží, všechny tyto geny jsou exprimovány tkáně specificky a v pravý čas přesně stejným způsobem, jako to dělá u lidí. Taková shoda byla zajištěna jejich bočních sekvencí, které obsahují promotor a další regulační elementy důležité. Použití YAC-transgenní myši byly získány, že syntetizované pouze lidské protilátky jsou tetramerní komplexní struktura ze dvou párů různých polypeptidových řetězců.

Lidské umělé chromozomy (lidské umělé chromozóm -HAC), které obsahují celý lidský imunoglobulinový lokus se těžký a lehký řetězec byly zavedeny do fibroblastů skotu, které se pak používají pro somatické přenosu jádra. Přijaté transkhromosomalnye telata expresi lidského imunoglobulinu v krvi. Tento systém byl důležitý krok ve směru živočišné výroby terapeutických lidských polyklonálních protilátek.

Další pozorování transgenních zvířatech ukázaly, že rekombinantní HAC byly udržovány ve většině první generace jedinců po několik let. Zda nebo ne dostal umělé chromozomy správně oddělit během meiózy a zdědil, to se teprve uvidí.

Nověji nová slibná technologie pro zvířata s postiženými geny - malé interferující RNA (siRNA, siRNA), které se používají k vypnutí zaměřovacího geny (umlčení). RNA interference - konzervativní post-transkripční regulační proces. Dvouvláknová malé interferující siRNA v 19-23 nukleotidů specificky váží na své komplementární sekvenci templátu cílové mRNA, řízení se po degradaci cesty.

RNA interference je součástí regulace genové exprese, a to systému kontroly / potlačuje translaci mRNA endogenních a exogenních virové prvky, a mohou být použity pro terapeutické účely. Pro přechodné genové vypnutí syntetické siRNA se transfekovaly do buněk nebo časných embryí. Pro stabilní genovou represi, by měl být siRNA sekvence začleněna do genomu jako součást genové exprese konstruktu.

Velmi účinná kombinace lentivirových vektorů s siRNA pro integraci do genomu. Na rozdíl od klasické knock-out strategie, která vyžaduje dlouhou chovné linie, pro získání čistého inaktivovaný gen v obou loci diploidní genom siRNA Integrace může snadno vypnout cílový gen v každém zvířat k dispozici online.

Přes široké škály metod pro produkci transgenních zvířat, až dosud žádné spolehlivé a efektivní technologii pro transgenních zvířat. Největší problémy se vztahují k vložení náhodného exogenní DNA do genomu s většinou existujících metod. Tak, že technologie zlepšení kvality dále nutné vyvinout pozorování modifikaci buněčných genů a přesné vložení exogenní DNA do genomu.

Čím více, že většina genomech hospodářsky významných organismů nyní zcela sekvenován a plánovat budoucí strukturu transgenních organismů. Kombinace plně dekódovaných genomových sekvencí s metod cílené dodávky exogenní DNA umožní konstrukci transgenních cílových genomů s předem určenými vlastnostmi.

NA Warriors, TG Volová

Sdílet na sociálních sítích:

Podobné