Preimplantační genové diagnostika

Jeho kombinace s testem na aneuploidie může zlepšit výsledky IVF. DNA preimplantační genodiagnostic připravený z polárního tělíska, biopsie krok drcení buď blastocysty zygota biopsie.

DNA analýza se provádí na polárním tělískem postupu oocytu fáze II. Hlavní nevýhodou této metody spočívá v tom, že za účelem potvrzení genotypu embrya, se vyžaduje prenatální diagnostika. Rekombinace chromozomů v 1. meiotického dělení může způsobit chybnou diagnózu. Ve většině center provést biopsii embrya, která může zjistit onemocnění, zděděné od jednoho rodiče. Bioptického obvykle získaný ve stupni drcení zygoty (krok osm buněk) selekci buněk, 1-2. Vzhledem k obtížím souvisejícím s diagnózou na takovém omezeném materiálu (viz. Níže), v ideálním případě lepší biopsii blastocysty, protože obsahuje až 300 buněk. Kromě toho se biopsie může být užíván trofoblastu, protože jsou snadno dostupné, a to není v rozporu s správný vývoj embrya. Nicméně, blastocysty biopsie se provádí ne ve všech centrech vzhledem ke složitosti její kultivaci buněk v kultuře a snížení přežití blastocyst po kryokonzervaci. Nicméně, použití těchto metod, je možné dosáhnout těhotenství, a časem, který má zkušenosti, jejich účinnost je pravděpodobně vzroste.

Materiál získaný v biopsii, analyzovány jedním ze dvou způsobů: PCR nebo fluorescenční hybridizace in situ. Laboratoře provádějící tyto zkoušky musí mít certifikát ve své zprávě uvést, které byla použita metoda, stejně jako dekódování výsledkem výsledků. Nicméně, specialista plodnost, je nesmírně důležité pochopit molekulární a genetické metody preimplantační genodiagnostic, jejich využití a jejich nevýhod.

PCR

PCR se nejlépe hodí pro diagnózu monogenní zabolevanij použít k určení pohlaví embrya je také, i když to bude nyní stále více používají fluorescenční hybridizace in situ. Pro identifikaci pomocí PCR mutace v konkrétním genu, je nutné před IVF vědět, co hledat mutace, a pre-výběr reakčních podmínek. V každé reakci, musí být zahrnuty do odpovídajících pozitivních a negativních kontrol, jinak výsledky nemůže být důvěryhodný. Je třeba připomenout, že v průběhu reakce může být celá řada výzev, k nimž patří:

1. nepřítomnost produktu PCR;
2. vzorek znečištění;
3. Ztráta alel.

Kromě toho, v mnoha centrech, pokud máte v úmyslu použít pro diagnostické PCR preimplantační, uchýlili k intracytoplazmatická injekce spermie, aby se zabránilo případné chyby v diagnostice způsobené zavedením pláštěm z průhledné a další spermií.

Vzhledem k tomu, preimplantační genodiagnostics množství templátové DNA pro PCR nestačí - obvykle několik pikogramů, zatímco normálně v ng PCR sto se používají, je třeba zvýšit počet amplifikačních cyklů. Pokud PCR DNA odebrané z jediné buňky (nebo více buněk) často vyžaduje 35-60 cyklů, zatímco standardní PCR (je-li množství vzorku, není limitujícím faktorem) - asi 30. Dalším řešením je PCR s primery vnořené (nebo jeden nested primer): dvě po sobě následující reakce pro amplifikaci malých množství cílového templátu. V posledních letech, jsme použili primery s fluorescenční značkou pro analýzu velmi malých množství DNA, čímž se zlepší citlivost PCR je asi 1000 krát a tím snížit počet amplifikačních cyklů.

Pro odstranění kontaminaci vzorku by měla být velmi pečlivě připravené a reakční směs se drží reaktsiyu- Kromě toho, v reakci zahrnují negativní kontrolu (reakční směsi, obsahující všechny složky s výjimkou DNA). Pokud je zjištěna negativní kontrola PCR produkt, možnost kontaminace vzorku cizí DNA - v tomto případě se PCR za následek zbytek vzorků nelze důvěřovat. Vzhledem k tomu, použití primerů s fluorescenční číslem návěští PCR cyklů menší pravděpodobnost kontaminace pod vzorku.

Ztráta alely znamená, že zesílený v podstatě jednu z alel, zatímco druhá zesílený velmi špatně, nebo ne zesílený vůbec. Je zřejmé, že to má největší hodnotu při určování onemocnění s autosomálně dominantní dědičnosti. V případě, že „ztratil“ dominantní alela obsahuje mutaci, chyba v analýze může vést k přenosu embrya do děložní dutiny, který obsahuje mutantní gen. Lze současně zesílit jiný blízko sebe DNA fragmentu, který má vysoký stupeň polymorfismu (vícenásobné PCR) Aby se obešel tento problém. Kromě toho, jak již bylo uvedeno, lze zlepšit citlivost PCR s použitím primerů s fluorescenční značkou.

Asociace preimplantační genodiagnostics Evropské skupiny pro lidskou reprodukci a embryologii (ESHRE) vyhodnotil diagnostickou přesnost PCR a fluorescenční hybridizace in situ. Podle letech 1999-2001., V 81 preimplantační genodiagnostic případě, poté, co byla provedena PCR s použitím prenatální a postnatální diagnostika- kde je chyba v diagnostice chorob zděděnou v Mendelian zákonů zjištěných v 5 případech (6,2%). Opakované diagnostika na potvrzení výsledků byla provedena pouze polovinu preimplantační diagnostiky. Je také třeba vzít v úvahu případy, kdy nebylo možné provést biopsii nebo nemožné diagnostikovat.

Fluorescenční in situ hybridizace

Tato metoda spočívá v tom, že sonda (jednovláknová DNA) nesoucí fluorescenční značku, hybridizuje s DNA z denaturovaného metafázové destičky, jednotlivých buněk nebo tkání. Způsob může být použit v preimplantační genových diagnostika pro:

1. embryo určování pohlaví pro nemoci X-vázaných, neexistuje žádná možnost, aby provedla PCR;
2. detekce chromozomálních translokací;
3. detekci změny v počtu chromozomů;
4. objevit jiné chromozomální abnormality, jako je například aneuploidie.

Ve studii aneuploidie na možné technické obtíže spojené s definicí počtu chromozomů. Pokud se pro analýzu jednotlivých buněk v interfázi přijata, je obtížné přesně určit počet signálů (jinými slovy, chromozomů) při issleduesh jedno jediné buňky. Pokud vidíte pouze jeden signál, může to znamenat, monozomie na tomto chromozomu, ale také překrývající se signály, nebo že hybridizace sondy s jedním z chromozomů se nezdařilo. Podobně přítomnost tří nebo více signálů může znamenat trizomie, ale může být vzhledem k technickým problémům: dvojitý signál vidění nebo abnormální fluorescence. Pro prodloužení diagnostické schopnosti může současně použít alespoň tři sondy: na chromosomu X, Y chromozom a autosomy onu z příkladu 18. chromozomu. V tomto případě by měla laboratoř vždy přísně sledovat kvalitu hybridizace k diagnostické přesnosti byla tak vysoká, jak je to možné, protože je známo, že ve studii 100 normálních diploidních buněk 100 párů signálů pro každého chromozómu nebude schopen přijímat. Diagnostické schopnosti bude expandovat, pokud to bude možné analyzovat větší počet buněk.

V tomto zjištění způsobu translokací běžně používaných sond lemující translokaci nebo upnuté polohy. Vzhledem k tomu, bezprostředně po přípravě pro IVF oocytů polární tělesa obsahují kondenzované metafázujících chromozomů sondy mohou být použity pro „obraz“ chromozómy v kombinaci s centromerických sond s částmi (alfa satelitních repetic) a určité loci. Bohužel, buňky z štěpení fázi zygoty nebo do stádia blastocysty, takové sondy jsou nevhodné, protože chromozómy nemohou být v metafázi a nedostatečně pojistkou. Způsob, při kterém se sondy použít k subtelomeric regiony chromozomu specifické chromozomální translokace dochází mezi nimi a centromerickou část sondy, proximální vzhledem k místa translokace. Takové sondy mohou detekovat v interfázi dekompenzované translokace, ale nemůže rozlišovat mezi normálním chromozomu od chromozomálních translokací s kompenzovaným.

Podle zprávy Asociace pro preimplantační genodiagnostics Evropské skupiny pro lidskou reprodukci a embryologii, fluorescenční in situ hybridizace se získá chybný výsledek v 8 případech z 145, kdy po stanovení diagnózy prováděné preimplantační prenatální a postnatální (5,5%). Mezi chybné diagnóze - dva případy trizomie, jeden mozaika s trizomií, je monosomii a jeden kompenzována a dekompenzované translokace. Kromě toho studie o aneuploidie byl nepozorovaně trizomie chromozomu 21. Stejně jako je tomu v případě PCR potvrzení fluorescenční in situ hybridizace výsledků byla provedena za méně než polovina žen, které podstoupily preimplantační genové diagnostiku.

Role fluorescenční in situ hybridizace pro stanovení translokace dnes není jasné, protože 50-70% případů, kdy rodiče jsou nositeli kompenzované reciproční translokace, kdy embrya jsou dekompenzované studie translokace. Tyto publikované údaje o výskytu úspěšné těhotenství po studiích se značně liší, ale podle údajů ze tří hlavních center frekvenci těhotenství, pokud jde o užívání jedno vejce je 29%. Někteří autoři uvádějí, že preimplantační genetické diagnostiky snižuje riziko spontánního aborta- ale není jasné, zda to zvyšuje rychlost úspěšném ukončení těhotenství ve srovnání s přirozeným početím, protože více než polovina z embryí bude mít abnormality, a tudíž větší pravděpodobnost, v každém případě, nepřežije. Navzdory tomu, že preimplantační genetické diagnostiky testování pro aneuploidie byla opakovaně použita s IVF, žádný z publikovaných randomizovaných prospektivních studií neprokázala významný nárůst počtu úspěšného výsledku těhotenství. IVF s preimplantační diagnózu - invazivní a nákladný postup, a proto je důležité, aby přesně vymezit praktickou roli této metody.

Sdružení pro preimplantační genodiagnostics Evropská skupina pro lidskou reprodukci a embryologii

Vyvodit správné závěry z výsledků preimplantační genodiagnostic pomocí PCR a fluorescenční hybridizace provádí in situ, v praxi, že je stále ještě není vždy možné. Podle zprávy Asociace pro preimplantační genodiagnostics Evropské skupiny pro lidskou reprodukci a embryologii pro 1999- 2001 dvouleté., Provedených v 1197 ECO cyklů, jak je ukázáno na výsledcích dodatečného prenatální a postnatální diagnózy, genové diagnostika preimplantační pomocí PCR poskytla chybný výsledek v 5%, a s využitím fluorescence hybridizace in situ - 6% případů. také třeba si uvědomit, že následná diagnóza provedena menší než polovina času, tak, aby se počet chybných diagnóz může být příliš nízká. Tyto údaje však neznamená, že v 94% případů správné diagnózy byla provedena. Podle asociace se celková míra otěhotnění po sklizni vajec bylo 17%, biopsie byla úspěšná v 97% případů, diagnózu a schopný držet pouze 86% případů. Celkově to znamená, že správná diagnóza preimplantační diagnóza byla stanovena 85% případů. Ti, kteří jsou podstoupit preimplantační genových diagnostiku, je třeba upozornit, že v 15% případů, správná diagnóza nemůže dát.