Laboratorní diagnostika infekčních nemocí

Běžné typy testů zahrnují mikroskopie, testovací kultura, imunologické testy (testy aglutinace, například latexová aglutinace, enzymové imunoanalýzy, western blot, testy srážení a fixaci komplementu test) a způsoby identifikace nukleové a non-nukleové kyseliny. Obvykle test kultura - je zlatý standard pro identifikaci mikroorganismů, ale výsledky nemusí být k dispozici několik dní nebo týdnů. Kromě toho patogeny mohou být izolovány v kultuře, což je činí užitečné alternativní testy. Když se patogen provádí testovací kultury, a to je identifikován, může laboratoř také hodnotit jeho citlivost na antibiotika.

Některé testy (např., Gramovo barvení, obvyklá aerobní kultury) může detekovat širokou škálu patogenů. Ve stejné době, některé patogeny nemohou být v analýze identifikováno. Z tohoto důvodu, lékaři by měli být vědomi omezení každý test pro specifické mikroorganismy. V takových případech by lékaři měli vyžádat provedení zkoušek, které jsou specifické pro podezření z patogenu (např speciálních barviv nebo médium pro kulturu) nebo doporučovat určité laboratorní testy na výběr.

mikroskopie

Mikroskopie může být provedeno rychle, ale přesnost je závislá na zkušenostech pracovníkem laboratoře a kvality zařízení. Instrukce často omezují využití lékařů mikroskopie pro diagnostické účely je certifikovaný laboratoří.

Většina vzorků ošetřených barviv, které barevné patogeny, které je činí vyčnívat z davu, i když mohou být použity mokré preparáty unstained vzorky pro detekci hub, parazitů, informativní články z pochvy, mobilní organismy (např Trichomonas) a syfilis (mikroskopie, temné pole ). Detekce hub může být zlepšena použitím 10% hydroxidu draselného se k rozpuštění okolní tkáně a non-houbových organismů.

Ošetřující lékař požádal o malbu na základě pravděpodobných patogenů, ale ne barvení není 100% specifická. Většina vzorků zpracovává Gramovo barvení, a je-li podezření na mykobakterií, kyseliny barvení. Nicméně, některé patogeny jsou obtížné vidět při použití těchto metod. V takových případech vyžadují různé verze zbarvení nebo jiných identifikačních metod. Vzhledem k tomu, mikroskopická detekce mikrob obecně vyžaduje koncentraci asi 1h105 / ml, většina vzorky biologických tekutin (např., CSF), koncentrované (například odstředěním) před analýzou.

gram barvení. Gramovo barvení klasifikuje bakterie podle toho, zda zachovat krystalové violeti skvrnu (gram-pozitivní - modrá) nebo ne (g - červená). Kromě toho se ukazuje morfologii buněk (např., Bacily, koky) a jeho uspořádání (například diploidní clusteru řetězcem). Tyto funkce mohou pomoci v předvýběru antibiotik při čekání na konečnou identifikaci. K výrobě barvení dle Grama, laboratorní materiál zahřívá a pevných vzorků na snímku, a poté se obarví postupně Gramovo barvení fialové, jodu, aceton a kontrastní barvivo (obvykle safranin).

Kyselinu a mírné (modifikovaných) Kyselá barviva. Taková barviva se používají k identifikaci organismů odolné proti kyselinám (Mycobacterium sp.) A středně odolná vůči kyselinám organismů (zejména Nocardia sp.). Tato barviva jsou také užitečné pro barvení rody Rhodococcus a podobně, stejně jako oocysty některých parazitů (např., Cryptosporidium).

I když detekce mykobakterií ve sputu vyžaduje pouze přibližně 5 000 až 10 000 mikroorganismů / ml, mykobakterie jsou často přítomné v lidském těle na nižších úrovních, takže citlivost je omezena. Obvykle se několik ml sputa deaktivovat hydroxidu sodného a koncentrovány centrifugací a kyselinová barvení. To zlepšuje diagnózu, ačkoli některé mírně kyselé odolné organismy je obtížné odlišit od mykobakterií.

fluorescenční barvení. Taková barviva umožňují detekci patogenů při nižších koncentracích (1x10⁴ buněk / ml). Příklady - akridinové oranže (bakterie a plísně), auramin rhodamin a auramin O (mykobakterie) a kalkoflyuor bílá (houby, zejména dermatofyty).

Sloučenina fluorescenčního barviva do protilátkou namířenou na patogenu (přímé nebo nepřímé imunofluorescenční) zvyšuje citlivost a specifičnost diagnózy. Nicméně tyto testy jsou obtížně číst a interpretovat, a několik (např, přímé testy fluorescence a pneumonii Legionella protilátky) jsou komerčně dostupné a běžně používané.

barvení inkoust. Toto barvivo se používá k detekci hlavně Cryptococcus neoformans a další skryté houby ve formě suspenze promytých buněk (např., CSF sraženina). Barevný sekundární domény a nikoli tělo sám, díky němuž je možné vidět žádné kapsle kolem těla jako svatozář. U jiných patogenů zkouška není tak citlivý jako detekce kryptokokovou antigenu. Specifičnost metody je také omezen: bílé krvinky mohou objevit skryté patogeny.

Wright Giemsa barvení a. Taková barviva se používají k detekci parazitů v krvi, Histoplasma capsulatum fagocyty a tkáňové buňky, intracelulární inkluze tvořené viry a chlamydie trophozoites pneumonie jirovecii a určité intracelulární bakterie.

Trichromatickým barvení (barvení Gömöri - Wheatley) a železný hematoxylinem barvení. Tato barviva se používají k detekci střevní prvoky.

Dye Gömöry - Whitley se používá k detekci Microsporidia. Nemůže odhalit helminthů vejce a lichinki- nelze spolehlivě identifikovat Cryptosporidium. Houby a lidské buňky jsou také obarveny.

Železo hematoxylin obarvení diferencované buňky, aktivuje buňky a jádra. hlístů vejce lze natírat v tmavé barvě, což ztěžuje identifikaci.

kultura

Testovací kultura - mikrobiální růst na pevném nebo kapalném zvýšení živin polovině počtu organismů usnadňuje identifikaci. Kultura také usnadňuje testování citlivosti k antibiotikům.

Video: Diagnóza zánětu močového měchýře. Part 3 052-2506596

Komunikace s laboratoří je důležitá. Ačkoli většina materiálu vzorku naočkuje na obecné použití média (např., Krve nebo čokoládový agar), některé patogeny vyžadují zahrnutí některých živin a inhibitory nebo jiné speciální usloviy--li jedna z těchto patogenů je podezření, nebo v případě, že pacient dostal antibiotika, je nutné hlásit do laboratoře. O zdroji zprávy vzorku tyto údaje do laboratoře mohou diferencovat patogenů z normální flóry.

Vzorkování je důležitá. Chybný typ tamponu může vést k falešně negativním výsledkům. Dřevěné tyčinky pro tyče stěr toxické k některým virům. Hole s bavlněným hadříkem špičky toxický pro některé bakterie a chlamydie. Krevní kultury vyžadují dekontaminaci a dezinfekci kůže (např., Povidon jod tampony se nechají oschnout a se odstraní 70% alkoholu). Běžně se používá několik vzorků, z nichž každý ze samostatného plotu mesta- s výhodou provádí při výšce horečky, pokud je to možné. Normální flóra kůže a sliznic, který roste dokonce ve stejném vzorku krve, působí jako infikovaný. Je-li vzorek krve získaný z centrální žíly nebo tepny, je třeba rovněž vzít vzorku periferní krve pomoci rozlišit systémovou bakteriémie z katetru infekce. Kultura infikovaných katetrů se obvykle stávají pozitivní rychleji a obsahuje více než organismy obou kombinovaných kultur periferní krve. Některé houby, zejména půdy (například Aspergillus sp.), Obvykle nemohou být kultivovaný od vzorků krve.

Vzorek by měl být rychle přepravovat ve vhodném médiu a za podmínek, které omezují růst jiným potenciálně infikování flóry. Pro přesné stanovení množství patogenu být zabráněno růstu patogenních další kopie musí být okamžitě transportovány do laboratoře, nebo, je-li dopravní zpoždění, které v lednici (ve většině případů).

Existují speciální podmínky pro určité plodiny.

Anaerobní bakterie by neměly být studovány v testovací kultuře, as diferenciaci patogenů z normální flóry často nemožné. Vzorky vzorky by měly být chráněny před vzduchem. anaerobní transportní média se používají pro tahy štětcem. Vzorky vzorky odebrané pomocí injekční stříkačky (například obsah absces), se musí přepravovat v injekční stříkačce.

Mykobakterie je obtížné pěstovat. Vzorky, které obsahují normální flóru (např., Sputa), musí být nejprve deaktivována a koncentruje se. Mycobacterium tuberculosis a některé jiné mykobakterie rostou pomalu. Růst M. tuberculosis, se objevují rychleji než v kapalinách v pevném médiu. Typicky je použití automatizovaných systémů s kapalným médiem může zvýšit v průběhu 2 týdnů ve srovnání s >4 týdny na pevném médiu (agar Lowenstein - Jensen). Navíc, malé množství organismů, může být přítomen v kopii. Plotové více instancí na stejném místě, může pomoci zvýšit pravděpodobnost detekce patogenu. V průběhu 8 týdnů nesmí být smíchán naočkuje médium. Je-li podezření na atypickou Mycobacterium, měl by informovat laboratoř.

Viry typicky pěstují na nátěrech a vzorcích tkání, obvykle přepravovány v prostředích, které obsahují antibakteriální a antifungální činidla. Obsah vzorků naočkovány vzorků v tkáňové kultuře, které podporují růst viru a inhibují všechny ostatní mikroby. Viry jsou velmi nestabilní (například zoster) se naočkují do kultivačního tkáni v průběhu 1 hodiny po odběru. Standardní tkáňové kultury je nejcitlivější. Express tkáňové kultury buněk (plaku metoda: počítání bodů na monovrstvě buněk) může poskytnout rychlejší, ale svědčí o výsledcích. Některé běžné viry nemohou být detekovány za použití obvyklých metod kultivace tkaney- vyžadují alternativní metody diagnostiky.

Vzorky houby odvozené z nesterilních míst se inokuluje do prostředí, které obsahuje antibakteriální činidlo. Instance musí být uchovávány po dobu 4 týdnů před likvidací.

test citlivosti

Citlivostní analýzy určit mikrobiální rezistenci vůči antibiotikům vystavením standardizované koncentrace antibakteriálních léků. Analýza citlivosti může být provedeno pro bakterie, plísně a viry. U některých organismů, výsledky získané z jednoho léčiva předvídat výsledky těchto léčiv. Tak, ne všechny potenciálně jsou testovány účinná léčiva.

Test citlivosti se provádí in vitro, a nemusí brát v úvahu mnoho faktorů, přírodní podmínky (například farmakokinetika a farmakodynamika, funkce koncentrace léku v určitých tkáních a orgánech lidského těla imunitního systému), které mají vliv na úspěšnost léčby. To znamená, že výsledky testů na citlivost není vždy předvídat výsledek léčby.

Citlivost testu může být kvalitativní, semikvantitativní nebo za použití metod pro izolaci nukleových kyselin. Analýza může také vyhodnotit účinek kombinované použití různých antibakteriálních léčiv (test společné účinky).

kvalitativní metody. Kvalitativní metody jsou méně přesné než semikvantitativní. Podle výsledků normálně pevné citlivosti (S), meziproduktu výsledek (I) nebo její odpor (R). Nejčastěji se používá metoda diskové difúze (také známý jako testovací Kirby - Bauer) vhodné pro rychle rostoucích organismů.

Antibiotikum napuštěné disky byly umístěny do agarové misky, na kterých se testuje mikroorganismus. Po inkubaci (obvykle 16 až 18 hodin) se měří průměr inhibiční zóny kolem každého disku. Každá kombinace antibiotika mikroorganismus mají různé průměry, které mají hodnotu S, I, nebo R.

Jiné metody, které vyžadují méně přísné dodržování testovacích parametrů mohou být použity pro rychlou kontrolu individuální organismus rezistentní na konkrétní lék nebo třídu léků nebo specifických antibakteriálních kombinace (např., Odolnost vůči oxacilinu v meticilin-rezistentní Staphylococcus aureus, výroba B-laktamázy).

Semi-kvantitativní metody. Semikvantitativní způsoby stanovení minimální koncentrace léčiva, které inhibuje růst určitého organismu in vitro. Minimální inhibiční koncentrace (MIC) se stanoví jako číslo, které pak mohou být považovány za jeden ze tří skupin: S (citlivé), I (střední), nebo (rezistentní) R. MIC Stanovení se používá hlavně pro bakterie, včetně anaeroby a Mycobacterium je někdy používán k houbám, zejména druhu Candida, odvozených ze sterilních míst. Koncentrace Minimální neutralizuje (baktericidní) (MBC), může být také stanovena, ale je technicky obtížné, a normy pro interpretaci dosud dohodnuty. MBC analýza je hodnota, znamená to, zda lék může být bakteriostatický nebo baktericidní.

Antibiotikum může být rozpuštěn v agaru nebo půda, která se potom přidá do mikroorganismu. Zesvětlení vývar - zlatý standard, ale je to časově náročné, protože jen jedna koncentrace léčiva mohou být testovány v jedné zkumavce. Účinnější způsob používá pás polyesterové fólie pásu impregnovaného odpovídající antibiotikum koncentraci. Proužek se umístí na agarovou misku obsahující vložení materiálu, a IPC určuje umístění na pásu, který začíná ingibitsiya- velké množství antibiotik může být kontrolována na tutéž desku.

IPC umožňuje korelaci mezi citlivost mikroorganismu na léčiva a koncentrace léčiva v dosažitelné látky, non-protein (bez léčiva). V případě, že koncentrace volného léčiva v tkáni je vyšší než MIC, pravděpodobnost úspěšné léčby je vysoká. Podobně údaje o S, I a R jsou v korelaci s BMD. Obvykle jsou založeny na dosažitelných koncentracích volného léčiva v séru nebo plazmě.

Metody pro detekci nukleových kyselin,. Tyto testy jsou založeny na metodách detekce nukleových kyselin, podobných těm, které slouží k identifikaci mikroorganismu, ale upravený pro detekci známých genů rezistence nebo mutace. Příklad - mecA, gen rezistence na oxacilin v S. aureus-, je-li přítomen gen, organismus se za rezistentní ke všem-laktamových antibiotik. I když je známo mnoho takových genů, ale jejich identifikace není oprávněna určitou závěru o odporu in vivo. Kromě toho, protože se mohou představit nové mutace nebo jiné geny resistence, jejich nepřítomnost nezaručuje citlivosti na léčiva. Z těchto důvodů a proto, že testy jsou omezeny co do počtu a jsou drahé, nejsou široce používány. Metody pro detekci nukleových kyselin, nenahrazuje standardní testovací kultury a obvyklou analýzu citlivosti.

Imunologické testy na infekční nemoci

Imunologické testy s použitím antigen pro detekci protilátek proti patogenu nebo protilátku pro detekci patogenní antigen ve vzorku pacienta. Léčba se liší, ale pokud potřebujete odložit analýzu vzorku, zpravidla by měl být umístěn v ledničce nebo zmrazení, aby se zabránilo přemnožení bakterií.

aglutinační testy. V aglutinace se testy (např., Latexová aglutinace, koaggregatsiya) částice (latexová kulička nebo bakterie), připojený k činidla antigenu nebo protilátky. Výsledné částice komplexu se smíchají se vzorkem (např., CSF, sérum) - je-li to žádoucí protilátka nebo její antigen přítomen ve vzorku, zesíťovací částic se vyskytuje ve formě aglutinace, která může být měřena.

Pokud jsou výsledky pozitivní, zkoumána biologická tekutina postupně naředěny a testovány. Aglutinace s více zředěných roztoků indikuje vyšší koncentrace požadovaného antigenu nebo protilátky. Titr správně zaznamenat jak vzájemné slepení po zředění v příkladu rozpouštění 32, naznačuje, že aglutinace proběhla v roztoku zředěné na 1/32 původní koncentrace.

Video: Laferobion

Aglutinační testy obvykle rychlejší, ale méně citlivé, než mnoho jiných metod. Mohou také stanovit sérotypů některých bakterií.

doplňkem fixace. Tento test měří spotřebu komplementu (fixace komplementu) protilátek v séru nebo mozkomíšním moku. Tento test se používá k diagnostice některých virových a plísňových infekcí, zejména kokcidioidomykózou. Vzorek je inkubován se známým množstvím komplementu a antigenu. Rozsah fixace komplementu udává relativní množství protilátek ve vzorku. Tento test může měřit titr protilátek IgG a IgM, nebo může být upraven tak, aby detekci specifických antigenů. Analýza přesné, ale má omezené uplatnění, je časově náročné a vyžaduje mnoho ovládacích prostředků.

imunoanalýzou. Tyto testy používají protilátky navázané na enzymy, k detekci antigenů nebo detekci a kvantifikaci protilátek. Linked immunosorbent assay (ELISA) a enzymový imunotest, jsou nejvíce používány Enzyme-Linked-linked immunosorbent (ELISA). Vzhledem k tomu, nejcitlivějších imunotesty vysoká, se běžně používají pro screening. Titry může být určena sériovým ředěním vzorku, jako je tomu v aglutinačního testu.

Analýza citlivosti i když obvykle vysoké a mohou se lišit v závislosti na věku pacienta, sérotyp mikrobů, například vzorku nebo klinickém stádiu onemocnění.

Analýza srážek. Tyto testy měří antigenu nebo protilátky v tělních tekutinách stupně viditelného depozice komplexů antigen-protilátka v gelu (agaróza), nebo v roztoku. Existuje mnoho typů analýzy na srážení (např Ouchterlonyho dvojitou difúze, proti imunoelektroforézy), ale jejich použití je omezeno. Typicky, vzorek krve se smísí s testovanou antigen pro detekci protilátek ochranné, často s plísňovou infekcí nebo pyogenní meningitidy. Jako pozitivní výsledek vyžaduje velké množství protilátky nebo antigenu, citlivost je nízká.

Western Blot Analysis. Tato analýza ukazuje, antibakteriálních protilátek ve vzorku materiálu odebraném z těla pacienta (např., Sérum, jiné tělní tekutiny) jejich reakcí s antigeny (například virové složky), které byly imobilizovány na membránovou blotů.

Při Western blot analýzy, zpravidla dobrá citlivost, i když je často menší než u screeningových testů, jako je ELISA, ale obecně má vysokou specifitu. To je běžně používané potvrdit pozitivní výsledky získané v testu screeningu.

Technické změny lineární Western blot imunostanovení (LIA) - analýza rekombinantní imunoblot (RIBA), který používá syntetický nebo rekombinaci-binant vyráběný antigeny- a imunochromatografický test, který může rychle testovat vzorky pro konkrétní mikrobiálních antigenů nebo protilátek pacienta.

Metody pro identifikaci nejsou nukleové kyseliny pro detekci infekčních nemocí

Jakmile se zkušební organismus kultura byla identifikována, je třeba identifikovat. Metody detekce-non-nukleové použít fenotypové (funkční nebo morfologické) je k dispozici mikroorganismy, spíše než genetické identifikace.

Rysy růstu patogenu v živném médiu - velikost kolonií, barva a tvar, poskytují informace k identifikaci druhů a s obarvením Gram a algoritmu pro další analýzy. K dispozici četné biochemické testy- každý charakteristický pro určitý typ mikroorganismů (např aerobní nebo anaerobní bakterie). Někteří odhadují, schopnost těla využívat celou řadu substrátů pro růst. Jiné odhady přítomnost nebo aktivita klíčových enzymů (např., Koaguláza, kataláza). Analýzy se daří, krok za krokem. testovací sekvence je velmi různorodá a v různých laboratořích se může mírně lišit.

Metody detekce-non-nukleové může být založeno na Manuálu automatizovaných systémů, nebo se může jednat o chromatografické metody. Některé komerčně dostupné kity obsahují samostatné baterie testů, které lze provádět pomocí jediného vzorku materiálu, a je obecně užitečný pro diagnostiku širokého spektra mikroorganismů. Tyto testovací systémy mohou být velmi přesné, ale může trvat delší dobu, až několik dní.

chromatografické metody. Mikrobiální složky nebo produkty jsou odděleny a identifikovány za použití vysokoúčinné kapalinové chromatografie (HPLC) nebo plynovou chromatografií. Typicky, detekce je porovnáním mastných kyselin organismu do databáze. Chromatografické metody mohou být použity k identifikaci aerobní a anaerobní bakterie, mykobakterie a hub. Přesnost závisí na analýzy kvality testovací kultury vzorku a kvalitě databáze, která může být nepřesná nebo neúplná.

Metody pro identifikaci infekčního onemocnění založené na detekci nukleových kyselin

k identifikaci nukleových kyselin na základě zobrazení některých metod DNA organismu nebo RNA extrahované z mikroorganismu. Tyto sekvence mohou být amplifikovány in vitro. na detekci techniky nukleových kyselin na bázi jsou obecně velmi citlivé a specifické a mohou být použity pro všechny typy bakterií. Výsledky lze získat rychle. Protože každá analýza je obvykle specifické pro konkrétní organismus, lékař potřebuje znát diagnostické možnosti a požádat o příslušné analýzy. Například, pokud má pacient symptomy, svědčící chřipky, ale chřipka období je u konce, drží celkem virové diagnostický test (např virová kultura), spíše než zvláštní analýzu chřipce je lepší, protože jiný virus (např, parainfluenza, adenovirus), může být způsobují.

na stanovení nukleových kyselin na bázi jsou kvalitativní testy, ale kvantitativní metody stanovení existují pro omezený, ale zvýšení počtu infekcí (např. HIV, cytomegalovirus, lidský T-lymfotropní virus). Tyto metody mohou být užitečné pro diagnostiku a sledování odpovědi na léčbu.

Metody, které nezahrnují amplifikaci nukleové kyseliny se používají v případech, kdy se organismus poprvé objeven v testovací kultury a je přítomna ve vzorku, při vysoké koncentraci.

rozšíření. Ve způsobech amplifikace nukleové kyseliny, které se malé množství DNA nebo RNA, reprodukovat mnohokrát, a tak může detekovat malé stopy mikroorganismu ve vzorku. Tyto metody jsou zvláště užitečné pro činidla, které je obtížné kultivovat nebo identifikovány pomocí jiných metod (např., Viry jsou obligatorní intracelulární patogeny, houby, mykobakterie, některé jiné bakterie), nebo pro ty organismy, které jsou přítomny v malých množstvích.

Tyto testy mohou zahrnovat cílové amplifikaci (např. PCR, reverzní transkriptáza-PCR [RT-PCR], amplifikace obvod předpětí, zesílení transkripce) zesílení signálu (například analýza rozvětvené DNA hybridní snímání), amplifikaci vzorku (např., Řetězová reakce ligázy , představuje formu štěpení cyklický test) nebo postamplifikatsii analýzu (např., sekvenování amplifikovaného produktu, mikročipové analýzy a likvidu křivky analýzy, jako je tomu v PCR v reálném čase).

Vhodné vzorkování a skladování před příjezdem do molekulární diagnostické laboratoře, je důležité. Vzhledem k tomu, metod amplifikace tak citlivé, snadno k falešně pozitivním výsledkům z stopové kontaminaci vzorku nebo zařízení mohou být instalovány. Navzdory vysoké citlivosti, někdy jsou falešně negativní výsledky, a to i když má pacient klinické příznaky (například virové infekce West Nile). Falešně negativní výsledky mohou být minimalizovány

• vyloučením použití hůlky pro nátěrech s dřevěnými pruty a špičky vlny
• rychlá přeprava vzorků
• zmrazení nebo umístěním vzorků v chladničce, pokud přeprava provádí >2 hodiny.

Zmrazení - typický způsob ukládání testy amplifikace nukleových kyselin. Nicméně, vzorky musí být uchovávány v chladničce, a nejsou předmětem zmrazení Pokud existuje podezření na nestabilní viry (např, herpes zoster, virus chřipky, HIV-2), nebo pokud se v plánu studovat virové kultury (zmrazené vzorky nejsou vhodné pro standardní plodiny).