Krev radioimunotest (RIA) aplikace

V roce 1956 byly poprvé objeveny u pacientů léčených inzulínem, nepretsipitiruyuschie protilátky schopné vazby ¹³¹I-inzulín. Potom tato výzkumná skupina ukázala, že neznačené inzulín soutěží se značenou protilátkou o vazbu k a vytlačuje ji z imunitních komplexů. Následně Berson a Yalow vyvinula první metoda měření RIA koncentrace inzulínu v séru, pro které byla udělena Nobelova cena. V této metodě se inzulín vázané na protilátky se oddělí od nevázaného inzulínu papírovou elektroforézou. Přibližně ve stejnou dobu, v roce 1960., Grodsky a Forsham popisuje podobný způsob, který využívá RIA ¹³¹I-inzulín, ale separace vázaného a nevázaného hormonu, že byl použit místo solení elektroforéza.

Enormní příspěvek k rozvoji RIA Hales a Randle provedeny v roce 1963 oddělit vázaného i nevázaného hormon se používá anti-y-globulin, takzvané sekundární protilátky. Tento přístup je založen na práci Skom a Talmadge, který v roce 1958 ukázala, že sekundární protilátky vysrážení komplexů „protilátky na antigen primární“. Hales a způsob Randle, nazvaný „způsob dvojité protilátky“, se ukázala být mnohem citlivější a specifičtější než předchozí verze RIA.

V roce 1963, Herbert a spol. Vyvinuli jsme techniku ​​pro separaci komplexů „antigen-protilátka“ od nevázaného antigenu aktivního uhlí potaženého dextranem. Metoda je založena na vlastnosti dřevěné uhlí dextranové směsi v podstatě okamžitě absorbovat volného antigenu bez vazby s komplexy antigen-protilátka. Tento postup umožňuje oddělit imunitní komplexy mnohem byst7 ráhno než pretsipitatsionnye technik, takže jej můžete použít ¹³¹I-antigeny s nízkou specifickou aktivitou značené Hunter a Greenwood.

Video: Teach kreslená Winx?

Zároveň Utiger et al. rozšířil rozsah použití RIA, vyvinout metodu pro kvantifikaci lidského růstového hormonu. Později Greenwood et al. implementovaný způsob jodace STH, což umožňuje získat značený hormon se specifickou aktivitou 200 až 500 mCi / mg (6.000-9.000 Ci / mmol).

Tato technika se používá dodnes. Jeho podstata spočívá v tom, že se jód izotop (1311 nebo 1251), ve složení jodidu sodného se oxiduje pomocí chloraminu T a v této formě nahrazuje jeden nebo více atomů vodíku ve fenylovém kruhu, tyrosin a histidin imidazolového kruhu. Po 1 min se reakční směs se přidá redukční činidlo, aby se předešlo zbytečnému poškození hormonu. Všimněte si, že zásada oxidačního jodace proteinů bylo popsáno v Hughes 1957 V dalším Meyer Knobil a vyvinut pro měření RIA opičího a lidského růstového hormonu, vyznačující se tím, Aktivní uhlí, použité pro separaci nenavázaného hormon.

Původ RIA pro měření hladiny gonadotropními hormony (v tomto případě - H), vyvinuté v roce 1966, v založen na použití protilátek proti lidskému CG, protože bylo dříve prokázáno, že tyto protilátky se váží na lidský a LH. Jedním z pokusů v této oblasti učinila skutečnou revoluci v imunochemie: Catt a kol. Zjistili jsme, že protilátky jsou schopné přilnout na discích diazotuje polystyrenu. Tak, což eliminuje potřebu pro separaci komplexů komplexu antigen-protilátka, vysrážením nebo adsorpce. Později Catt a kol. naučil imobilizovanou protilátku přímo s nenasycenou polystyrenu v alkalickém prostředí. Výsledky těchto studií sloužily jako základ pro tvorbu ELISA (viz. Níže). Faiman a Ryan se poprvé podařilo získat antisérum podvěsku gonadotropinu - lidský LH. Následně RIA pro stanovení krysí LH byly vyvinuty.

Vývoj RIA pro měření hladiny FSH, jako je tomu v případě LH, začínají s okem na budoucí klinický výzkum. V roce 1967 a 1968. několik výzkumných skupin zprávu o nové metody RIA pro různé formy lidského FSH. Všechny z nich jsou založeny na metodě dvojité protilátky.

V roce 1967, Aria a Lee poprvé oznámili způsob stanovení prolaktinu, na základě způsobu dvojité protilátky. První měření hladiny prolaktinu pomocí RIA byly provedeny v nepřítomnosti lidského materiálu u ovcí a skotu plazmy.

Teoretické základy RIA

První metody RIA (například, metody Berson a Yalow nebo Grodsky a Forsham) byla založena na jevu kompetitivní inhibice. Tento jev spočívá v tom, že vazba izotopem značené hormonu (stopovací antigen) se specifickými protilátkami inhibovány v přítomnosti neznačeného hormonu (neznačeného antigenu). Fenomén kompetitivní inhibice lze popsat pomocí dvou rovnic: ‚značený antigen + protilátka komplex je označena‚a‘neznačenou antigen + protilátka <-> немеченый комплекс». Таким образом, число молекул меченого гормона, входящих в состав комплексов антиген—антитело, обратно пропорционально исходному числу молекул немеченого гормона в реакционной смеси. Иначе говоря, радиоактивность комплексов, отделенных от несвязавшихся антител и антигенов, будет тем выше, чем ниже была концентрация немеченого гормона.

Typicky RIA prováděny při teplotě 4 nebo 37 ° C ve fyziologickém roztoku pufrovaném fosfátem při pH 7 nebo 8. Reakční může trvat od 2 do 24 hodin (v závislosti na afinitě protilátky a požadované úrovně citlivosti). Všimněte si, že automatizaci analýzy a zlepšené způsoby produkce protilátek významně snižuje reakční dobu. Když se reakční směs, je usazen rovnováha, komplexy antigen-protilátka se oddělí srážením se sekundárními protilátkami, antigeny a absorpcí volných protilátek na aktivním uhlí nebo srážením ve vysoké hustotě médiu, jako je polyethylenglykol. Pokud pevné fázi RIA, inkubační médium se potom odstraní a komplexy antigen-protilátka zůstane na polystyren nebo jiné pevné fázi. V posledním kroku radioaktivity komplexy. V případě, že hormon byl označen ¹²⁵I nebo ¹³¹I, s použitím proti záření v případě, že značka sloužil 3H, částice za použití scintilačního čítače. koncentrace hormonu ve vzorcích se vypočítá z kalibrační křivky připravené z měření ve standardních vzorků se známými koncentracemi hormonu.

Příprava protilátek

Polyklonální protilátka byla připravena imunizací RIA antigenu (hormon) zvířat různých druhů, včetně pro králíky, slepice, morčata, kachny, ovcí a koz. Pro primární protilátkou (anti-hormon) se běžně používá u králíků a morčat pro sekundární protilátkou (anti-primárního) - ovce a kozy.

Video: Alergie na psí plemeno Pudl

Existuje mnoho způsobů imunizace, nejčastější - injekce antigenu do tlapek, nebo v regionálních lymfatických uzlin nebo sleziny. Vzhledem k tomu, v hostitelském existují antigeny na krátkou dobu, pro spolehlivé indukci imunitní reakce s použitím Freundova adjuvans. Neimunogenní antigeny s nízkou molekulovou hmotností (například steroidní hormony) a antigenů s nízkou imunogenicitou před imunizaci připojené k velké molekuly nebo částice (methylovaného albuminu, feritinu, dextran, Sephadex a m. P.). Imunizace se obecně provádí v několika stupních v intervalech 2 týdnů. Typicky, po několika injekcích titru protilátek v séru rychle roste. Krev pro imunního séra odebraného z dutinách srdce nebo žil a tepen ucha. Druhá metoda se nejčastěji používá u králíků. Výsledná séra byla inkubována 30 minut při 57 ° C, aby zničil komplement. Potom se v séru se přidá konzervační činidlo pro zabránění růstu bakterií a hub (azid sodný nebo thimerosal).

monoklonální protilátky

V roce 1975, Kohler a Milstein vytvořil zcela nový - hybridomů - technologie pro produkci protilátek. Později se tento vývoj byla udělena Nobelova cena. Popíšeme hlavní prvky této technologie.

Myši nebo krysy jsou imunizovány s antigenem, jako je například hormon. Když se titr protilátek v séru dostane dostatečně vysoké, v imunitních zvířata z obec Zenk izolovaný plazmatických buněk, mezi nimiž jsou buňky - producenti protilátek proti výchozímu antigenu. Plazmatické buňky v myelomových buněk in vitro hybridizovány odvozených živočicha stejného druhu. Buněčná suspenze byla převedena do selekčního média, ve kterém tak hybridní buňky přežít, a plazmové a Nye myelomové buňky hynou. Hybridní stát po dobu jedné nasazený do jamek chlorovodíkové střední podavačem, kde jsou dělené a vzniku hybridomů (imortalizované buněčné linie). Z množiny vybrat ty hybridomy, které produkují protilátky s požadovanou antigen a násobit jejich živného prostředí nebo v peritoneální dutině syngenních myší. Z pitatelno- střední nebo ascitu izolované protilátky. Tyto protilátky se nazývají monoklonální, protože jsou produkovány hybridomem jsou potomky jedné plazmatické buňky. Monoklonální protilátky produkované hybridomy, rozpozná pouze jeden epitop antigenu. To je zásadní rozdíl mezi monoklonální protilátky z polyklonálního antiséra, které obvykle obsahuje několik různých protilátek proti různým determinantám antigenu.

Jednou z důležitých výhod monoklonální protilátky polyklonálních spočívá v tom, že stejný druh monoklonálních protilátek s definovanou specifičností a afinitou mohou být vyrobeny v libovolném množství a prakticky nekonečné (jako nesmrtelné hybridomu). Naproti tomu, protilátkové kompozice polyklonálního antiséra je velmi proměnná, kterou je třeba kontrolovat každou novou šarži antiséra a výběr podmínek jeho používání. To znamená, že použití monoklonálních protilátek mnohem snazší standardizovat RIA a jiných imunochemických testů.

Získání hormony, radioaktivně značené

Jak již bylo uvedeno, pro iodization proteinových hormonů nejčastěji používanou metodou navrženou Greenwood a Hunter. Původně použitý jako značka ¹³¹I, ale vzhledem ke krátkému poločasu rozpadu tohoto izotopu (8 dnů) trvanlivost značeného hormonu byl malý. V roce 1967, Wilde a spol. použity pro iodization ¹²⁵I (T_1/2 = 60 dní). Od té doby se izotop používá k označení jakýkoliv protein, a některé neproteinové hormony. Takto získané označené hormony se specifickou aktivitou 100-250 mCi / mg. To je dostatečné pro spolehlivou detekci částic v čítače záření.

Pro označování použití nebílkovinného hormonu a další radioaktivní izotopy, jako jsou radiátory částice ³H nebo ¹⁴C. označené ³H nebo ¹⁴C steroidy se používají nejen v imunochemické analýzy hormonů, ale také v základních endokrinologické studií, například pro studium lokalizace steroidních receptorů v různých buňkách a tkáních pokusných zvířat.