Hematologické účinky nové aktivity mutantní p53 do buněčného cyklu, apoptózy a citlivosti na cytostatika

Porušení funkce p53 jsou nejuniverzálnější v různých nádorů molekulyarnymizmeneniem osoby. Mohou voznikatlibo i v normálních buňkách a tím zvyšuje veroyatnostobrazovaniya neoplastické klonu ní, nebo může být uzhev nádorové buňky a určí další postup novoobrazovaniya.Sleduet zdůraznit, že změnou regulace kletochnogotsikla kontrolních bodů a apoptózy, p53 dysfunkce upravit chuvstvitelnostkletok na protinádorových léčiv.

Je pravidlem, že v nádorech odhalil missense mutace p53, privodyaschiek jedna aminokyselina je nahrazena jinou, a s největší chastotoymutatsii nalezené ve třech "hot spots": Kodonah175, 248 a 273. Pravděpodobně exprese mutantní p53 váže kletkedopolnitelnye selektivní výhodu oproti buněk, ve kterých se mění v genu p53 vést ke ztrátě ekspressiipovrezhdennogo alely. Tuto skutečnost lze vysvětlit tím, krayneymere dvou důvodů. Za prvé, mutantní protein má dominantní negativnymeffektom proti proteinu divokého typu, tj mutatsiyadazhe bod v jedné ze dvou alel, je schopen zcela potlačit ohrannuyufunktsiyu p53. Za druhé, v posledních letech jsou uvedeny údaje naznačující existenci mutovaných forem p53 nově získaných aktivit ("získají-of-function"). Je známo, například, že pro schettakih aktivity mutantní p53 se může specificky a s vysokoyaffinnostyu vážou MAR / SAR DNA prvky, což způsobuje remodelirovaniehromatina, trans-aktivovat promotory několika genů (onkogenem myc, receptor epidermálního růstového faktoru a další.) A uvelichivatmetastatichesky potenciál nádorové buňky. Nicméně molekulyarnyeosnovy nově získané činností a jejich role je prakticky nebyla studována kantserogenezapoka procesů.

Pokusili jsme se zkoumat dopad nově priobretennyhaktivnostey mutantní p53 na regulaci buněčného cyklu, apoptozai citlivosti na cytostatika. K tomu, abychom byly studovány effektymutantnyh p53 aminokyselinové substituce v kodonech 175, 248 ili273 bytí "hot spots" razlichnyhopuholyah mutací u lidí. Nový mutantní p53 aktivita byla detekována transdukcí do kultivovaných buněk in vitro bez produtsiruyuschieendogenny p53. Použití buněk postrádajících p53 ekspressiyaendogennogo, možné vyloučit existenci dominantní-negativnogoeffekta a zkoumání účinku nově získané pouze aktivnosteytransdutsirovannogo mutantní p53.

Získali jsme a deriváty lidské buňky analyzovány myshii konstitutivní nebo tetracyklin-represibilní ekspressieyekzogennogo p53. Ve druhém případě, exprese mutantního r53podavlyalas přidáním tetracyklinu do kultivačního média (1mkg / ml). 24-48 hodin po přenosu kontaktní subliniykletok získané v médiu bez tetracyklinu indukce pozorovány ekspressiiekzogennogo mutantní p53 není provázeno zvýšením ekspressiigenov cílové divokého proteinu p53 (p21WAF1 et al.).

Vliv nových aktivit mutantní p53 v buněčném cyklu míra buněčné proliferace

Nově získané mutantní p53 aktivita způsobuje suschestvennoeuvelichenie rychlost proliferace buněk. Tak, zavedení vektoru konstitutivně exprimujících mutantní p53-His175, povyshaetskorost reprodukční p53-negativní myší fibroblasty linii10 (3) je přibližně 1,5 :. snížil z 23,5 hodin do 16 hodin v logaritmické fázi růstu populace buněk bylo pozorováno vremyaudvoeniya Shodnayakartina v případě tetracyklinem regulovaný ekspressiir53-His175 v lidského plicního karcinomu linie N1299ili myší fibroblastové linie 10 (1), což potvrzuje, že se svyazvyyavlennyh rozdíly v rychlosti proliferace ekspressieymutantnogo přesně s p53, a ne s sekundární změny voznikayuschimiv výsledkem kontinuálního selekčního s exogenní mutantnymr53 buňkami. Mělo by být zdůrazněno, že indukce exprese p53 divokého typu buněčných kontextech nevedla k poklesu, ale uvelicheniyuvremeni zdvojnásobení buněčné populace nebo apoptózy.

Zrychlení buněčné proliferace pod vlivem nově priobretennyhaktivnostey mutantní p53 je způsobeno, zdá se, že jejich vozdeystviemna regulaci buněčného cyklu. Analýza kinetiky vzhledu mechenyhmitozov po přidání 5-bromdeoxyuridinu po dobu 20 min., Jsme opredelyaliprodolzhitelnost jednotlivých fází buněčného cyklu růstu logarifmicheskoyfaze. Bylo zjištěno, že zahrnutí exprese mutantního r53znachitelno zkracuje čas pro buněčného cyklu trvání zkrácení schetsuschestvennogo S-fázi. Tak mutantnyyr53 žádný významný vliv na trvání drugihfaz buněčného cyklu.

Nově získané mutantní p53 aktivity, navíc k izmeneniyregulyatsii buněčného cyklu za normálních fyziologických podmínek, mohou modifikovat G1-kontrolní bod funkce aktivovatelný povrezhdayuschimivozdeystviyami. Zjistili jsme, že indukce exprese mutantnogor53-His175 buněk 10 (1) a H1299 vede k tomu, že se S-fazuvhodit 1,5-2 krát více buněk s poškozením DNA, indutsirovannymialkiliruyuschim sloučenina ethyl-methansulfonát (EMS), potom p53 divokého kakekspressiya typ, naopak snižuje podíl povrezhdennyhkletok obsažen v s-fázi. Ve stejné době, p53-His175 prakticheskine ovlivňuje činnost kontrolního bodu působí v G2.

Mechanismy jsme identifikovali účinky nově získaných aktivnosteymutantnogo p53 v regulaci buněčného cyklu, dokud neyasny.Naibolee věrohodné, je předpoklad, že tyto izmeneniyasvyazany se schopností p53-His175 zvýšení exprese genamyc. Jeho produkt, jak již bylo uvedeno, může, na jedné straně, trans-aktivovat gen ornitindekarboxyláza, a volání, a tím onemocnění, zkrácení S-fáze, a na druhé straně aktivovat kompleksytsiklin E / CDK2 a zrušit zastavit poškozené buňky v perehodeiz G1 až S ,

Vliv nových aktivit mutantní p53 v indukci apoptózy

Mutantní p53 může modifikovat účinek cytostatik, pouze izmenyayane regulace G1-kontrolní bod, ale i oslabení indukci apoptoza.Pri této nové aktivity mutantního p53 působí jako naapoptoz způsobené poškození DNA a apoptózu indukovanou"doména smrti" ("receptory smrti") V kultivačním médiu posledobavleniya TNF-a nebo anti-Fas. Sleduetpodcherknut, že tyto účinky mutantní p53 ve velkém stepenizavisyat na specifické substituce aminokyselin, jako je například apoptóza a možná i buněčných souvislostech. Tak, p53-His175, mnohem silněji než p53-Trp248 nebo p53-His273, inhibuje apoptózu indukovanou DNA povrezhdayuschimivozdeystviyami (EMC, etoposid). Ve stejné době, p53-His273 silnější než p53-His175, potlačuje Fas-indukované apoptózy v karcinomu prostaty chelovecheskihkletkah linii PC-3. Kromě toho, různé mutantnyer53 různě ovlivňovat apoptózu indukovanou Fasi TNF-a.

Mechanismus účinku nově získaných aktivit v oblasti regulace apoptózy mutantnyhr53 studoval až docela špatné. Nedavnoobnaruzheno, že jedním ze způsobů, takové regulace může yavlyatsyatrans kabelky1-aktivaci genu kódujícího antiapoptotických beloksemeystva BCL2.

Dopad nových aktivit mutovaného proteinu p53 v chemoterapeutické léky chuvstvitelnostk

Kromě nespecifické účinky na citlivost na tsitostatikamposredstvom změny v regulaci buněčného cyklu a apoptózy, novyeaktivnosti mutant p53 může mít větší citlivost spetsificheskoedeystvie na některé léky sredstvamputem změny v regulaci chemoterapie cílů. Použití hybridizační metodsubtraktivnoy jsme identifikovali neznámý raneemisheni transaktivaci mutantní p53 účinku a bylo zjištěno, že skupina genů specificky aktivován mutovaného genu p53 obsahuje kódující deoxy-UTP-ASE. Funkčního dUTFazy zaklyuchaetsyav hydrolýzy dUTP na skládku a pyrofosfát. Na druhé straně, za vzniku Dump sluzhitsubstratom dTTP de novo. Předpokládá se, že povyshenieurovnya dUTFazy může způsobit rezistenci na 5-fluoruracil, shirokoprimenyaemomu chemoterapeutické látky, jejichž mechanismus účinku inhibicí syntézy svyazans dTTP timidilatsintetazy.My potlačením aktivity zjištěno, že indukce p53-His175 nebo p53-His248, jakož i zavedení konstruktu vyjadřující UTP -azu, dokonce i ve všech zkoumaných kulturách (karcinom plic H1299, rakyaichnika SKOV-3, fibroblastů 10 (1), do 1,5 až 2 krát zvýšená chislokletok schopné tvořit kolonie po expozici na 5-fluorouracil a.Pri tento odpor na dvou různých léků - metotreksatui adriamycin - nezvýšil současně p53-His273, neobladayuschy schopností trans-aktivovat genový UTP-ase ne uvelichivalustoychivost údaje kultivaci buněk na 5-fluoruracil ..

Je zřejmé, že existují i ​​jiné způsoby, ve kterých mutant p53 aktivita vnovpriobretennye vlivu chuvstvitelnostkletok na určité cytostatik. Tak bylo zjištěno, že vleykoznyh K562 buňky, na rozdíl od buněk 10 (1), a kol., Expression of p53-His175 způsobuje významnou redukci chuvstvitelnostik methotrexát. Exprese tohoto mutanta málo uvelichivalatakzhe rezistence leukemických buněk k vinblastin akční noprakticheski nezměnila citlivost na etoposidu. Ve stejné době, exprese p53-His273 není snížena, ale naopak, několik povyshalachuvstvitelnost buněk K562 k metotrexátu, a vinblastin. Mehanizmyetih účinky zůstávají nejasné.

Tak bylo zjištěno, že nově získané aktivnostimutantnyh p53 substituce aminokyselin v různých polohách razlichnymobrazom ovlivňovat citlivost na různé chemoterapeutické léky. Prietom se mohou lišit nejen účinek různých mutantní p53 vody a stejný typ buněk, ale také působení stejných mutantav buněk různého původu. To vše je nutné uchityvatpri probíhající pokusy ispolzovatmutatsii p53 předvídat výsledky protinádorové chemoterapie.