Non-izotopové metody imunoanalýzy hormonů

Jednalo se o první metoda pro přesné kvantitativní stanovení hormonů, je široce používán a hraje obrovskou roli v laboratorní diagnostiky onemocnění žláz s vnitřní sekrecí. Je založen na moderních principech vytvořených RIA imunologických hormony. Nicméně, v posledních dvaceti letech, RIA byl téměř zcela vyřazen z klinické praxe neizotopovými metodami imunoanalýzy - ELISA a analýzy immunohemilyuminestsentnym. Základem těchto metod, stejně jako v RIA založené na interakci antigenů a protilátek, ale použije se pro štítek non-radioaktivní izotopy, a enzymy, které katalyzují reakci, za vzniku barevného produktu, nebo luminiscenční látky. V prvním případě je konečná fáze analyzovat optické hustoty reakční směsi v druhé - počet fotonů vyzařovaných luminiscenční látkou.

Video: Regionální laboratorní a diagnostické centrum imunochemické metody výzkumu IHMI

imunoanalýzou

Pro kvantitativní stanovení hormonů nejčastěji používá na pevné fázi ELISA se dvěma protilátkami. To se provádí ve více-jamkových plastových desek. V dolní části jamek sorbován monoklonální protilátky specifické pro konkrétní antigenní determinant hormonu. Jamky byly sera vzorky s neznámých koncentrací hormonů nebo standardních vzorků se známými koncentracemi hormonu. Destička byla inkubována po dobu 30-120 min-té doby, hormonů molekuly podaří spojit s protilátkami adsorbovaných na plastu. Po inkubaci byly jamky promyty pufrem pro odstranění nenavázaného hormonu a další komponenty v séru. Pak byly jamky výrobu polyklonálních protilátek na hormon konjugované s peroxidázou (tzv konjugátu), a destička byla inkubována po dobu 15-30 minut. Kde molekula konjugát se váže na molekuly hormonů. Jamky byly znovu promyty, aby se odstranil nenavázaný konjugát a přidá se k roztoku, který obsahuje jejich bezbarvý peroxidázový substrát. Peroxidáza převede substrátu na barevný produkt. Intenzita barvení roztoků v jamkách (to se měří ve fotometru) je přímo úměrná množství konjugátu ve studni, a to je - koncentrace hormonu. koncentrace hormonu ve vzorcích séra se vypočítá z kalibrační křivky připravené z měření koncentrací hormonů standardních vzorků.

Je třeba zdůraznit, že tato metoda ELISA, na rozdíl od výše popsaných způsobů RIA, je nekompetitivní. Skutečnost, že v reakční směsi, v případě neexistence značeného antigenu a hladiny vazby polyklonálních protilátek (konjugát) s antigenem, adsorbovaného na monoklonálních protilátek je závislá na koncentraci antigenu ve vzorku. Metody Nekompetitivní se používají i při analýze immunohemilyuminestsentnom.

Immunohemilyuminestsentny analýza

Existuje mnoho možností, immunohemilyuminestsentnogo analýzy. Popíšeme příklad provedení, který se používá k měření hladiny gonadotropinů v moderní Autoanalyzer. V tomto provedení, hormon se používá k vázání paramagnetických mikročástic potažených monoklonální protilátky vysoce specifické pro daný hormon. Mikročástice se suspenduje v roztoku pufru a přidá se k suspenzi vzorků séra nebo standardních vzorků. Po krátké inkubaci (10- 20 min) mikročástic s navázaným hormonu se vysráží v magnetickém poli a promyje se několikrát. Pak se mikročástice resuspendují v pufru a přidá se k suspenzi polyklonálních protilátek k hormonu konjugované s alkalickou fosfatázou. Po promytí nenavázaný konjugát se přidal do suspenze mikročástic dioksetina fosfátu. Působením alkalické fosfatázy fosfátu dioksetina vytvořena dioksetin vyzařující luminiscenční záření. Intenzita luminiscence, která se měří fotonásobičem, je přímo úměrná koncentraci hormonu ve vzorku.

Video: Laboratorní studie

Metody pro detekci autoprotilátek

Reprodukční poruchy mohou být přímo nebo nepřímo způsobené autoimunitních patologických stavů. Například může být mužské neplodnosti způsobené autoimunitní odpovědi proti spermatu, a v patogenezi ženské neplodnosti může hrát roli autoimunitní onemocnění štítné žlázy nebo nadledvinek. Markery autoimunitních patologií jsou autoprotilátky. Pro detekci sérových protilátek (např antifosfolipidové protilátky, protilátky proti yodidperoksidaze nebo 21-hydroxylázy) použit ELISA metoda analýzy immunohemilyuminestsentny a nepřímé imunofluorescence. V druhém případě, jako antigenní substrát pomocí hluboce zmražené řezy tkání, proti kterému je autoimunitní reakce namířená. Pro detekci protilátek proti spermiím ve spermatu a způsob microagglutination cervikálního hlenu používaných s latexovými částicemi potaženými protilátkami proti IgA nebo IgG.

jiné metody

U některých hormonů, jako jsou katecholaminy a serotonin, není snadné vytvořit spolehlivé metody imunologického testu. Skutečnost, že tyto materiály mají velmi nízkou molekulovou hmotností, a proti nim je obtížné získat vysoce specifických primárních protilátek, monoklonálních i. Podobné problémy vznikají při vývoji metod pro imunochemické stanovení steroidních hormonů a jejich derivátů (vzhledem k vysoké pravděpodobnosti zkřížené reakce s různými primárními protilátkami steroidů, které mají velkou antigenní podobnost). Proto je pro přesné kvantitativní analýzu takových činidel v posledních letech se stále častěji používá vysoce účinné kapalinové chromatografie s následnou hmotnostní spektrometrií.

Často, endokrinní poruchy, včetně poruch reprodukce, nejsou způsobeny patologickými změnami v úrovni gonadotropinu a pohlavních hormonů a jejich receptorů mutací. Pro posouzení funkce receptoru dříve použita biologické testy in vitro: pacient se biopsii tkáně, která je cílem hormonu, biopsie byly umístěny do kultivačního média bylo přidáno do média a vyhodnocovány hormonální reakce tkáně na tento hormon. mutace dnes receptoru zjištěné stanovením DNA sekvence nukleotidů v odpovídajících genů. DNA pro takové testy jsou obvykle připraveny z lymfocytů pacientů.