VWF antigenu: způsob určení

Na povrchu plastových jamek destičky sorbován protilátek proti von Willebrandova faktoru. V první fázi výzkumu v jamce mikrotitrační destičky se přidá BTP vzorků. VWF molekul jsou upevněny na příslušných protilátek, a zůstávají vázány při praní. Ve druhém kroku v analýze jamky tvorby polyklonální protilátky. V další fázi vyšetřování v jamce chromogen roztoku se přidá. Tato látka je natřena po enzymem. Intenzita barvení závisí na obsahu von Willebrandova faktoru.

Imunologický způsob stanovení von Willebrandův faktor může být také provedena za použití raketového elektroforézy.

Variační koeficient ELISA pro stanovení vWF: Ag je menší než 10%.

Video: Stanovení krevní skupiny a Rh faktoru

Reakční činidla a zařízení

• Koncentrát promývacího pufru (pH 7,3).
• inkubační pufr (PBS- pH 7,3).
• Lyofilizované standardy.
• Lyofilizované kontrolní vzorky s nízkou a vysokou úrovní.
• Konjugát polyklonálních protilátek.
• roztok substrátu.
• Přestat řešení.

Video: Krev (antigeny krevních skupin, Rh) [Je to jednoduché]

Distributor Diagnostická souprava činidel - CJSC "BIOHIMMAK".

Krevní vzorky pro výzkum

Chcete-li provést zkušební Willebrandův faktor pomocí PPP.

výkon technika

Konstrukce kalibrační křivky. Dále je třeba pro vytvoření kalibrační křivky pomocí lineární souřadnicový systém. Pro konstrukci kalibrační křivky pomocí hodnotu absorbance získané zředěním vzorku se známou koncentrací von Willebrandova faktoru. Na ose x je aplikován na koncentraci VWF: Ag v U / ml nebo procent (1 U / ml = 100%) a na ose y uvádí absorbanci. V těch případech, kde jsou vzorky, jejichž hodnota absorbance větší, než je hodnota nejvyššího kalibračního bodu, musí být dále zředěn inkubačním pufru (1 + 1) a znovu testovány. Tak výsledná koncentrace měření musí vynásobit faktorem zředění.

Vyhodnocení výsledků studie

Koncentrace vWF: Ag u zdravých lidí se velmi liší. Předpisy jsou závislé na verzi diagnostické soupravy, zařízení, krev, činidel, a ještě mnohem více, takže není všeobecně přijímané normální rozmezí při měření tohoto ukazatele. Normální rozsah je obvykle uvedeno v návodu výrobce činidel pro stanovení von Willebrandova faktoru, ale mnozí výrobci doporučují, aby si každá laboratoř stanovila svůj vlastní rozsah normálních hodnot. Je důležité si uvědomit, že průměrné hodnoty hladiny tohoto proteinu s I krevní skupiny je asi o 10% nižší než u jiných pacientů, které by měly být vždy považovány v diagnóze hemoragické onemocnění.

Příčiny chyb

• Absence nebo neúčinnost systému vnitřní kontroly kvality. V současné době k dispozici vzorky referenčních materiálů certifikované hodnoty s von Willebrandova faktoru. Vzhledem k tomu, že přítomnost zásadně odlišných metodologických přístupů k určení bílkovin, je nutné pečlivě zkontrolovat verzi studie, pro které byl testovaný vzorek certifikovaného.
• Nesprávné dávkování citrátu na odběr žilní krve. Nedostatek citrátu sodného, ​​protože nízký hematokrit a hemolýzy vést k chybám a non-reprodukovatelné výsledky.
• Hemolýza.
• Zvýšení vWF pozorovány ve stresových situacích v průběhu cvičení, těhotenství, krvácení, vysoký krevní tlak, infekčních chorob, estrogenové terapie. U žen, u různých dnů menstruačního cyklu, může být kolísání koncentrace von Willebrandova faktoru. Standardizovat hormonální vliv na obsahu multimerní protein, někteří odborníci doporučují pro diagnostiku von Willebrandova onemocnění u žen mezi 5. a 7. den menstruačního cyklu.

Další analytické techniky

Bohužel, neexistuje žádný jednotný postup, který může vzít v úvahu všechny z mnoha variant tohoto proteinu anomálií, ale pro diagnostiku vWD vyvinula řadu laboratorních testů. Základní výzkumné metody používané k identifikaci nedostatků nebo kvalitativní abnormalitu von Willebrandova faktoru, založené na použití enzymových imunologických technik. Kromě toho, pro diagnostiku onemocnění studovat efektivně funkci agregace běžných krevních destiček ošetřených ristocetinu přidání PRP vyšetřovaného. Za účelem kvalitativního poruchy diferenciace molekuly tohoto proteinu dále zaměstnance a další metodické postupy.

Určení ristocetin-kofaktoru von Willebrandova faktoru

Formalinem ošetřené destičky ztrácejí schopnost provádět mnoho z jeho funkce, r. H. tvorbu a funkční jednotky, v závislosti na přídavku nejvíce známé funkce induktory agregace, ale s přidáním ristocetinu ve směsi těchto destiček a plazmy studie, které se rychle aglutinují. V tomto zkušebním systému závažnost aglutinace je přímo závislá na přítomnosti von Willebrandova faktoru, avšak s klesající koncentrací tohoto proteinu nebo jeho kvalita méněcennosti takové aglutinace slabě exprimován nebo chybí úplně. Existují dvě možnosti prinitsipialno podobné metodiky pro stanovení ristocetin-kofaktoru von Willebrandova faktoru. Původ - kvantitativní, k jeho provedení vyžaduje agregometru, druhý - semikvantitativní, zahrnuje vizuální posouzení okamžiku výskytu aglutináty ve směsi ředění testované plazmy a ristocetinem formalinem ošetřené krevní destičky. Obě metody mají variační koeficient menší než 10%.

Diagnostické metody nutné rozlišovat různé verze von Willebrandovy nemoci

Stanovení kolagenu vázající aktivity von Willebrandova faktoru. Adheze krevních destiček na subendoteliální kolagenových vláken uskutečňuje prostřednictvím receptoru krevních destiček GP-Ib / V / IX. Tato interakce vyžaduje vWF jako kofaktor, takže v anomálií multimerní protein nebo jeho nedostatečná kapacita narušen vazby na receptory kolagenu destiček. Ke stanovení aktivity kolagenu vazba vyžaduje soubor činidel a zařízení k provedení testu ELISA. Jeho variační koeficient není vyšší než 15%.

Stanovení multimérního von Willebrandova faktoru. Moderní diferenciální diagnostiku většiny variant typu 2 vWD je také založen na studium multimerní von Willebrandova faktoru. Pro stanovení schopnosti tohoto proteinu tvořit multimery stále více používají imunitní elektroforézy. Postup pro stanovení multimerní poměrně komplikované, vyžaduje zařízení pro imunitní elektroforézy vhodné provádět ve specializovaných laboratořích rutinně provádět imunitní elektroforézy, diagnostické soupravy pro jeho realizace není. Informace o citlivosti a specifity této diagnostické metody v současné literatuře není zastoupen, ale existují zprávy o dosud neznámých verzí multimerního proteinu, který někteří odborníci považují jako diagnostické artefakty.

Stanovení agregace krevních destiček s ristocetinu (R1PA). Porušení agregace destiček indukovanou ristocetinem je časté laboratorní Willebrandova projevem onemocnění. Toto provedení pro identifikaci vysoce specifický subtyp 2B von Willebrandova choroba, v nichž je abnormálně vysoká agregace v odpovědi na přídavek nízkých koncentrací ristocetinem. V jiných anomálií, tato metoda je pouze druhořadý význam, protože je obvykle dávka může být rozdělena na různá provedení této patologie. Chcete-li implementovat tuto techniku ​​vyžaduje agregometru a ristocetinového. Reprodukovatelnost studie agregace s ristocetinu do značné míry závisí na agregometru modelu, zkušeností a odbornou přípravu pracovníků.

Video: Krev seskupení by přestřelce a Rh faktoru