Základy molekulární terapie. genová terapie

Video: Molekulární podstata individualizaci terapie s častými mutacemi v NSCLC

Zřízení umístění a sekvence genu, jehož mutace způsobují specifické onemocnění, stejně jako většina moderních metod mutace a jeho testování může diagnostikovat onemocnění v neo, a dokonce i prenatální vývoj organismu. Díky tomu je možné zmírnit projevy genetickým defektem o léčbě drogové závislosti, strava, krevní transfúze, atd

Avšak tento přístup nevede k odstranění vady a, obecně, dědičné onemocnění, nelze vyléčit. Situace je komplikována skutečností, že mutace jednoho genu může produkovat různé účinky na tělo. V případě, že mutace způsobuje změnu aktivity enzymu, pro který kódů, může to vést k hromadění toxického substrátu, nebo alternativně k deficitu sloučeniny potřebné pro normální fungování buňky.

Dobře známý příklad takové nemoci je fenylketonurie. Je způsobena mutací v genu pro jaterního enzymu fenilalanindegidroksilazy katalyzovat přeměnu fenylalaninu na tyrosin. Výsledkem je zvýšení endogenní hladiny fenylalaninu v krvi, což způsobí nesprávnou tvorbu myelinové pochvy kolem axonů nervových buněk v centrálním nervovém systému a v důsledku toho těžké mentální retardace.

V případě, že mutace ovlivňuje gen strukturální protein, pak to může vést k vážným poruchám na úrovni buněk, tkání nebo orgánů. Příkladem takového onemocnění je cystická fibróza.

Delece v genu, který kóduje protein nazývaný cystická fibróza transportér vede k syntéze defektního proteinu (nedostatek fenylalaninu 508) a poruchami transportu chloridových iontů přes buněčné membrány. Jedním z nejvíce škodlivých důsledků toho je, že hlen, která lemuje a chrání plíce, se stává mimořádně silná. To komplikuje přístup do buněk plic a přispívá k akumulaci škodlivých mikroorganismů. Buňky lemující dýchacích cest v plicích, jsou usmrceni a nahrazena jizevnaté tkáně (odtud název nemoci). V důsledku toho, že pacient umírá z respirační selhání.

Dědičné choroby se liší komplexní klinické příznaky a jejich léčba traditsinnoe především symptomatická: pro léčbu fenylketonurií bezalaninovuyu předepsanou dietu, výměnu vadných funkční proteiny, intravenózní podávání, pro kompenzaci ztracené funkcí vykonávaných transplantaci kostní dřeně nebo jiných orgánů. Všechna tato opatření jsou většinou neúčinný, nákladný a trvanlivý a málo pacientů přežije do stáří. Proto je vývoj nových léčebných postupů je velmi naléhavá.

genová terapie

Genová terapie se nazývá genetické inženýrství lidských somatických buněk, zaměřené na korekci genetický defekt, který způsobuje onemocnění. Korekce specifických onemocnění se provádí zavedením do defektních buněk normálních somatických exprimovaných genů. Pro 80-let. Nejsou-li vytvořeny vyvinuté metody pro přípravu jednotlivých genů a eukaryotických expresních vektorů, se stává rutinní přenos genů experimenty u myší genetickou korekce perspektivní stanou skutečností.

V roce 1990 v USA Dr. W. French Anderson (W. francouzský Andrson) první pokus o genové terapii pro léčbu těžkou kombinovanou imunodeficiencí (SCID) na tříleté dívky Ashanti de Silva (Ashanthi da Silva) byly vytvořeny. Tato nemoc je způsobena mutací genu kódujícího adenozanadenilazu (ADA). Nedostatek tohoto enzymu umožňuje hromadění adenosin a deoxyadenosintrifosfátu krve, toxický účinek, což vede ke smrti B a T lymfocytů v periferní krvi a v důsledku imunodeficitu.

Děti s tímto onemocněním by měla být chráněna před jakýmkoli infekcí (obsažené ve speciálních sterilních komory), jako jakékoliv onemocnění může být fatální. 4 roky po zahájení léčby dítě pozorovat expresi normálně fungující ADA SCID a úlevu od příznaků, který dovolil, aby odjela sterilní komory a žít normální život.

Tak bylo prokázáno, v zásadě možnost úspěšného genové terapie somatických buněk. Od 90-tých let. testováno množství genové terapii genetických chorob, mezi nimiž jsou nejtěžší, jako hemofilie, AIDS, různých typů zhoubných novotvarů, cystická fibróza a další. V současné době léčitelná pomocí transgeneze asi 10 lidských onemocnění.

Různé genetických chorob předem stanovené množství vývoje přístupy genové terapie. Tak vyřešit dva hlavní problémy: prostředky pro dodávání terapeutického gena- způsob poskytnutí cílené podání do buněk určených k nápravě. Doposud se všechny přístupy k genovou terapii somatických buněk mohou být rozděleny do dvou kategorií: (obr. 3.15), ex vivo terapii a in vivo.

Obr. 3.15. Schéma genové terapie ex vivo (a) a in vivo (a)

ex vivo genová terapie zahrnuje korekci genetický defekt buněk mimo tělo a pak se vracet normálně fungující buňky v těle.

v genové terapii in vivo zahrnuje dodání terapeutického genu přímo do buněk specifické tkáně pacienta. Vezměme si tyto postupy podrobněji.

ex vivo genová terapie zahrnuje následující kroky:
1) poskytnutí pacientovi deficientních buněk a jejich kultivaci;
2) přenos požadovaného genu do izolovaných buněk transfekcí terapeutického genového konstruktu;
3) výběr a kapacita geneticky korigované buňky;

4), transplantace nebo transfúze těchto buněk do pacienta.

S použitím vlastní buňky pacienta je zajištěno, že po svém návratu se nevyvinula imunitní odpověď. přenos postup genový konstrukt by měly být účinné, ale normální gen, by měla být zachována stabilně a trvale exprimovat.

Způsoby přenosu genů vytvořené povahy, jsou viry. Aby se dosáhlo efektivní přenos genů vektorů pro dvě skupiny virů, se používají hlavně - (viz obr. 3.16), adenoviry a retrovirů. geneticky detoxifikovaný variant virů používaných v genové terapii.

Obr. 3.16. Viry použité pro vytvoření terapeutických vektorů

Vezměme si zařízení a využití návrhů založených na retro-viry. Připomeňme, že retrovirový genom obsahuje dva shodné jednovláknové molekuly RNA, z nichž každý se skládá ze šesti sekcí: dvě dlouhé terminální repetice (LTR) na 5` a 3` končí nekódující sekvenci, * P + potřebné pro balení RNA do virové částice, a tři regiony, kódující strukturální protein vnitřní kapsidy (gag), reverzní transkriptázy (pOL) a obalový protein (env) (obr. 3.17, a).

Obr. 3.17. Genetická mapa typického retroviru (a) a retrovirového vektoru mapa (a)

Připomeňme, že retrovirus životní cyklus zahrnuje následující kroky:
1. Infekce cílových buněk.
2. Syntéza DNA kopie genomu s nativní reverzní transkriptázy.
3. Dopravní virové DNA do jádra.
4. Integrace virové DNA do chromosomu hostitelské buňky.
5. Uspořádání mRNA z virové DNA pod kontrolou silného promotoru lokalizovaného na 5`-LTR části.
6. Broadcast proteiny Gag, Pol a Env.
7. tvorbě virové kapsidy a balíček dvěma molekulami RNA řetězců a reverzní transkriptázy.
8. Uvolnění virionů z buňky.

Při přípravě retrovirového délky vektoru DNA retro viru vložena do plazmidu odstranit většinu genu gag a úplně geny pol a env, a místo toho vložen „terapeutický“ genu T a případně markerový selektivní gen Rg se svým vlastním promotorem (obr. 3,17, b ). T gen uspořádání bude řízen stejným silného promotoru lokalizovaného na 5`-LTR části. Na tomto schématu základě poskytuje různé retrovirové vektory, a maximální velikost DNA insertu o osm tisíc. Bp

Takto získaná struktura může být použita sama o sobě pro transformaci, ale jeho účinnost a následnou integraci do genomu hostitelské buňky, je velmi nízká. Z tohoto důvodu, je obal technika celková RNA retrovirový vektor, do neporušených virových částic byla vyvinuta, která s vysokou frekvencí do buňky a pronikají zaručené integrován do genomu hostitele. Pro tento takzvaný „pakuyuschaya“ buněčné linie byla založena. Dvě různé části chromozomů buněk šité retrovirové geny gag a pol-env, zbaveny schopnosti zabalit kvůli nedostatku konzistence + (84 * +) (obr. 3.18).

Obr. 3.18. Schéma pro získání baleného virového vektoru

To znamená, že oba tyto fragmenty jsou transkribovány, ale zároveň zbaven RNA prázdných kapsid. Transfekcí RNA virového vektoru v těchto buňkách je začleněn do chromozomální DNA a je transkribována pro vytvoření plné délky RNA retrovirus, a za těchto podmínek balených v kapsidy pouze RNA vektoru (pouze obsahuje sekvenci +). Výsledné intaktní virové částice se používají pro účinné dodávání retrovirového vektoru do cílové buňky.

Retroviry infikují pouze aktivně se dělící buňky značně. Pro přenos jejich geny se zpracuje s čištěnými částicemi balených retrovirového vektoru nebo společně kultivovány s buněčnou linií jejich výroby, a poté provést výběr pro separaci cílových buněk a balicí buňce.

Transdukované buňky byly pečlivě kontrolovány na úrovni syntézy genového produktu terapeutické, absence příslušného retrovirové replikace, žádná změna ve schopnosti buněk růst a funkci.

Zvláště vhodné pro genovou terapii, jsou buňky kostní dřeně. To je vzhledem k přítomnosti totipotentní embryonálních kmenových buněk, které mohou proliferovat a diferencovat do různých typů -B- buňky a T lymfocyty, makrofágy, erytrocytech, trombocytech a osteoklastů. Tyto buňky se používají k léčbě řady dědičných onemocnění, mezi nimi jsme již zmínili těžkou kombinovanou imunodeficiencí, Gaucherova choroba, srpkovitou anémii, talasemie, osteoporóza a další.

Kromě totipotentních kmenových buněk kostní dřeně, které jsou obtížné izolovat a kultivovat použité pupovinnoy kmenových buněk z krve (dává se přednost použití genové terapie pro kojence) a jaterních buněk - hepatocytů - pro léčbu hypercholesterolemie.

V genové terapii in vivo, že je obzvláště důležité zajistit doručení terapeutického genu do defektních buněk. Takové cílené dodání mohou poskytovat modifikované vektory, které jsou založeny na viry, které mohou infikovat určité buněčné typy. Zvážit přístup vyvinutý pro léčbu již bylo zmíněno výše cystickou fibrózou. Vzhledem k tomu, že plíce jsou otevřené dutiny, terapeutické geny dodat jim je poměrně snadné. Klonovaná varianta zdravého genu byla zavedena v inaktivovaného adenoviru (obr. 3.19). Specifičnost tohoto typu viru je, že se infikuje sliznici plic, což způsobuje rýmu.

Obr. 3.19. Systém pro získání vektoru na bázi adenoviru

Navrženy tak, aby byl virus testuje nástřikem do nosu a plic pokusných zvířat a pak se lidé-pacienty. V některých případech se zavedení a expresi zdravého genu, a obnovení normálního transportu chloridových iontů. Možná, že tento přístup (zavedení normálního genu nosním aerosolem) v blízké budoucnosti bude široce používají k léčbě příznaků cystické fibrózy v plicích.

Kromě retro- a adenovirů v genové terapii pokusy o použití a dalších typů virů, jako jsou například Herpes simplex viru. Znakem tohoto dvouvláknové (152 tis. Bp) DNA virus, je jeho schopnost specificky zasáhnout neurony. Existuje mnoho genetická onemocnění ovlivňující centrální a periferní nervový systém - nádory, metabolické poruchy, neurodegenerativní onemocnění (Alzheimerova choroba, Parkinsonova choroba).

Herpes simplex virus typu I (HSV), vektor je velmi vhodný pro léčení takových onemocnění. Kapsid viru pojistky s membráně neuronu, a jeho DNA je transportován do jádra. Je navrženo několik způsobů přenosu terapeutický gen pomocí HSV-vektorů a úspěšně testovány na experimentálních zvířatech.

Virové vektory mají několik nevýhod: vysoké náklady, omezenou kapacitu klonovaných a možných zánětlivých reakcí. Takže v roce 1999, jako výsledek, který vyvinuli neobyčejně silná imunitní reakce na adenovirový vektor byl zabit 18-letý dobrovolník, kteří se zúčastnili testování léku. V roce 2002, dvě děti ve Francii v průběhu léčení imunodeficitu (zavedení terapeutických genů do kmenových buněk za použití retrovirů) vytvořil stav podobný leukémii.

Proto vyvinul nevirový přenos genů systému. Nejjednodušší a nejméně účinným způsobem - to je injekce plazmidové DNA do tkáně. Druhý přístup - je bombardování mikroprojektily tkaniny zlato (1-3 mikronů), konjugované s DNA. Tak terapeutické geny jsou exprimovány v cílových tkáních a jejich produktů - terapeutických proteinů - do krevního oběhu. Hlavní nevýhodou tohoto přístupu je předčasné inaktivaci nebo zničení těchto proteinů s krevními složkami.

Zavedení DNA může být provedena zabalením do umělého lipidové membrány. Takto získané kulovité částice, liposomy mohou snadno proniknout přes buněčnou membránu. Liposomy vytvořen s různými vlastnostmi, ale zatím účinnost této dodávky je nízký, protože většina DNA byla podrobena lysozomální degradaci. Také syntetizovány DNA konjugáty pro dodávání genetického konstruktu do různých molekul, které jsou schopny zajistit jeho bezpečnost, cílené dodání a proniknutí do buňky.

V posledních letech, intenzivní pokusy vytvořit umělý chromozom 47, což by umožnilo začlenit velké množství genetického materiálu s úplnou sadu regulačních prvků pro jeden nebo více terapeutických genů. To by bylo možné použít genomovou verzi terapeutického genu, a tím zajistit jeho stabilitu a účinné dlouhodobou expresi. Pokusy ukázaly, že vytvoření umělých lidských chromozomů obsahujících terapeutické geny, je reálný, ale není jasné, jak taková obrovská molekula zavádí do cílového buněčného jádra.

Hlavních problémů genovou terapií, kromě rizika těžkých imunitních reakcí, jsou obtížné dlouhodobé skladování a provoz terapeutické DNA do těla pacienta, mnoho multigenních chorob, což je obtížné cíl pro genovou terapii, a rizika vyplývající z použití viru jako vektoru.

NA Warriors, TG Volová

Sdílet na sociálních sítích:

Podobné