Terapie-efekt geny odpovědné za syntézu proteinů aktinu a srdeční dystrofinu na rozvoj chronického srdečního selhání u pacientů s dilatační kardiomyopatií infarktem miokardai

DChcete-li porozumět mechanismům vzniku a progresi selhání hronicheskoyserdechnoy (CHF) Research poslednihlet zaměří na posouzení přínosu genetických faktorů vrazvitie oběhové selhání. Perspektivnympodhodom To je způsobeno tím, že se detekuje genetické riziko a proiskhoditprognozirovanie komplikací tohoto onemocnění až do jejich klinicheskihproyavleny [1, 2]. Proto v současné době na molekulární patogenezi kardiomyopatie urovnerassmatrivaetsya jako proiskhoditnarushenie v procesu genové exprese, zejména mehanizmovpretranslyatsii, překlad a posttranslyatsii, která vede k izmeneniyufenotipa [2]. Známý činnost s cílem identifikovat genetické faktorovrazvitiya CHF u pacientů s dilatační kardiomyopatií (DCM), a to zejména v těchto pacientů odhalila mutace v různých uchastkahgenov zodpovědné za syntézu proteinu dystrofin a aktin [3, 4,5, 6].
Neexistují žádné publikované zprávy o mutatsiigena dystrofinu a aktin u pacientů s infarktem myokardu, hotyamozhno předpokládat, že podobné mutace je možné na základě vliyaniemstressa a neurohormonální aktivace mechanismů.
V této souvislosti je cílem této práce bylo issledovaniegenov aktin a dystrofin u pacientů s idiopatickou dilatační kardiomyopatie, UY osob s infarktem myokardu.

Materiály a metody

V issledovanievklyucheno 130 pacientů, včetně 104 mužů a 26 žen, vozrasteot 21 až 88 let. Pacienti byli rozděleni do tří skupin: první skupinové macrofocal a pacienti s akutním infarktem myokardu transmurálního, komplikovaný CHF II - IV FC podle NYHA, 2. skupina - s infarktem miokardabez klinickými příznaky srdečního selhání, 3. skupinové pacientů s idiopatickou dilatační kardiomyopatií CHF II - IV FC. Kontrolyasostavilo skupina 30 lidí, včetně 21 mužů a 9 žen, vozrasteot 25 až 76 let (průměrný věk 55,5 let) bez kardiovaskulárního sosudistoypatologii a bez vážných chronických onemocnění.
Klinické a demografické charakteristiky bolnyhpredstavlena stůl.
Studium genů aktinu a dystrofin proizvodilosv Ústavu General Genetics, laboratorní a radiatsionnoygenetiki environmentální Ústavu biologie genu ras.
tselnayakrov byla použita pro extrakci DNA, které byly ve zkumavce s EDTA v konečné koncentraci 50mMili citrátu s konečnou koncentrací 0,5%. Izolace DNA provodilis za použití "DiatomTMDNA Prep 200" reagenční soupravy (vyrobeno "Biokom"). Základem izolaci DNA pomocí tohoto použití naboralezhit na lýzu činidla k DNA guanidintiotsionatomi sorbentu „Nucleos“. V přítomnosti vysokých koncentrací guanidintiotsionata (4M) DNA adsorbuje na aktivním povrchu částic „Nucleos“, a ostatní krevní komponenty zůstávají v médiu, které je pak udalyayutsyatsentrifugirovaniem. DNA promyje spirtosolevym vyrovnávací zatemsmyvaetsya extragenic sorbentu směsí iontoměniče a pro nastavení napryamuyuispolzuetsya polymerázová řetězová reakce (PCR) Izolace DNA z krve provedené v souladu se souborem instruktsieyispolzovannogo „DiatomTMDNA Prep 200“ „Biokom“ firmy.
Pro detekci mutací v genu metodou kardioaktinaispolzovali PCR-RFLP, PCR produktu, přičemž restrikční rezhetsyasootvetstvuyuschey enzym rozpoznává na body zájmu nukleotidnuyuzamenu. Restrikčním enzymem restrikční místo Bcl I (-TGATCA-) vyyavlyaetmissens mutaci G (norm) pro A (mutace), rozpuštěný v genové kardioaktina 5-exon spojené s idiopatické dilatační kardiomyopatie. Sintezpraymerov pro výzkum 5. exonu byl kardioaktina držení syntezátor PE Applied Biosystems (USA). Složení primery: F 5 / -gactcgttcccaggtatg R 5 / -gatctcccactcacaaaag.
PCR amplifikace byla provedena následujícím způsobem: rezhimeamplifikatsii 950S - 40, 580S - 30, 740S - 40 až 30 cyklech.
Velikost amplifikovaného fragmentu 222 parynukleotidov. Konečné koncentrace v reakční směsi PCR: 67 mM Tris HCl pH c = 8,8, 16 mM (NH₄)₂SO₄, 0,01% Tween 20,1 jednotek. Taq.polimerazy, 200 mM dNTP každý, 0,5 mM každého primeru 10-20ng DNA zkoumány, 1,5 mM MgCl₂,Konečný objem PCR směsi 30 ml.
Pro analýzu amplifikace za následek 10 mklPTsR produkt se nanese na 2% elektroforézou na agarosovém gelu. vgele DNA vyvinut s ethidiumbromidem pod UV světlem o vlnové délce 32 nm. Po vizuální hodnocení PCR koncentrace produktu opredelyaliobem PCR směs potřebných pro nastavení omezení reakce (5 až 10 l PCR směsi).

Vyšetřování dystrofinového genu

Pro obnaruzheniyamutatsii v genu pro dystrofin metodou PCR s sikvensspetsificheskimipraymerami (PCR-SSP), přičemž ispolzuetsyapara pro PCR primeru, z nichž jedna obsahuje jeden nebo dva tochechnyezameny. Jedním z substituce je zajímavá náhrada tochechnuyunukleotidnuyu. Princip této metody je, že se teplota prioptimalnoy napojené primery v nepřítomnosti mutace se objeví konkrétní pásmo PCR produktu, a v případě mutatsiipri stejné teplotě a žíhání primery amplifikatsiine reakce probíhá. Vybrané dva páry sikvensspetsificheskih praymerovprednaznacheny detekovat missense mutace A až G v 9. ekzonegena dystrofinu normální sekvence a mutace sootvetstvennosvyazannaya s X-vázanou idiopatické dilatační kardiomyopatie.
Syntéza primerů pro výzkum 5. ekzonakardioaktina byla provedena na syntetizátoru PE Applied Biosystems (USA).
Složení primeru: Dn 5-GTA AAT gtt GAC aga cctgtg 5-GAA CCT CTC CAG TCG ATC ACG Dm 5-GTA AAT gtt GAC aga cctgtg 5-GGA TCC TCT CTC GCA CGC gat
PCR amplifikace byla provedena následujícím způsobem: rezhimeamplifikatsii 950S - 40 s, 560C - 30, 740S - 40 pro 35 cyklů.
Velikost amplifikovaného fragmentu 160 parnukleotidov. Konečné koncentrace v reakční směsi PCR: 67 mM Tris HCl c pH = 8,8- 16 mM (NH₄)₂SO₄, 0,01% Tween 20,1 jednotek. Taq polymeráza, 200 mM dNTP každý, 0,5 mM každého primeru 10-20ng DNA zkoumány, 1,5 mM MgCl₂,Konečný objem PCR směsi 30 ml.
Tabulka. Klinické a demografické charakteristiky pacientů.

Pro analýzu rezultatovamplifikatsii 10 ul produktu PCR byla nanesena na 2,5% agarózovém gelu ukázala elektroforez.DNK gelu ethidium bromidem pod UV světlem dlouho volny320 nm.
Pro detekci bodovou mutaci v issleduemyhprobah zaznamenané amplifitsirovannogofragmenta přítomnosti nebo nepřítomnosti příslušného páru primerů:
1. Přítomnost PCR fragmentu o 160 párů nukleotidovpri zesílení pár primerů pro normální posledovatelnostiukazyvaet na normu.
2. Nepřítomnost PCR fragmentu s 160 parnukleotidov amplifikačního páru primerů pro normalnoyposledovatelnosti indikuje přítomnost zamýšleného mutace.
3. Přítomnost PCR fragmentu o 160 párech nukleotidovpri zesílení pár primerů pro mutatsieypodtverzhdaet sekvence s mutací.

Výsledky a diskuse

Jak již bylo zmíněno, v literatuře neexistují žádné zprávy o mutaci genu iaktina dystrofinu u pacientů s ischemickou chorobou srdeční, zejména sinfarktom myokardu, i když pod vlivem neurohormonů a dalších biologicheskiaktivnyh látek, které jsou aktivovány v odpovědi na povrezhdenieserdechnoy sval (v tomto případě, infarkt myokardu), vozmozhnopredpolozhit podobné mutace. Nicméně, i přes podmínek pravilnyeteoreticheskie a naše očekávání bylo zjištěno, že mutace genů sledovaných pacientů. Kromě toho, není opredelyalasmutatsiya a u pacientů s dilatační kardiomyopatií, i když se v posledních letech ve výzkumu rezultateryada získat dostatek významných výsledků v důsledku kotoryekasayutsya dystrofinu genovou mutaci a aktin s srdce nedostatochnostyu.V zejména R. Ortiz-Lopez et al. [2] zkoumány genomnuyuDNK 3 nepříbuzných rodin s X-vázanou dilatační kardiomyopatií.Kontrolní skupinu tvořilo 50 ženských jedinců a 50 mužských neyavlyayuschihsya příbuznými. Pro amplifikaci DNA byl použit výsledek PTSR.V studie v jedné z rodin s X-vázanou DKMPbyla identifikován gen kódující mutace dystrofin lokalizuyuschegosyav chromozomu 21, a to zejména, našel nahrazení adeninu guaninv exonu 9 v poloze 1043, která vedla k syntéze hydrofobní nepolyarnoyaminokisloty alanin místo hydrofilní polární threoninu přítomné v dystrofinu v poloze 279, který se týká KN-konci proteinu dystrofinu. Nahrazení threoninu alaninem izmeneniyupolyarnosti vede k N-konci proteinu, a tudíž změna vtorichnoyi dystrofinu terciární struktury. Tak, tento mutatsiyayavlyaetsya způsobit ztrátu membránové stabilizační funkce etogobelka poruch a funkční aktivity kardiomyocytů, chtoi vede k X-vázaných degenerativních onemocnění miokarda- X-vázanou dilatační kardiomyopatie.
F. Muntoni a kol. [4], a Milasini J. a kol. [5], popsané mutace v jiných místech distrofina.Eti genové úseky byly zkoumány R. Ortiz-Lopes et al. [3] tehzhe 3 rodiny s X-vázanou dilatační kardiomyopatie, mutace v těchto místech byly vyyavlenone. V důsledku toho můžeme uvažovat o různých mechanismů veduschihk vývoje distrofinopaties.
Proto by jakákoli mutace distrofinaprivodit k deficitu infarktu proteinu, který yavlyaetsyaprichinoy absence infarktu distrofinassotsiirovannyh glykoproteinů [7, 8] odpovědné za vazbu komplexu multiproteinnogo sbelkami extracelulární matrix. Výsledkem toho yavlyaetsyadezorganizatsiya kardiomyocyty, což vede ke změně mehanicheskoymodeli myokardu, narušení jeho čerpací funkce a srdeční selhání.
Pokud jde o mutaci srdečního aktinu soudruh v roce 1998 publikoval článek T. Olson et al. [6] prokázána studiemi dvou nezávislých semeys autosomální dominantní idiopatická kardiomyopatie (jeden semyanemetskogo původu, druhý - švédský-norský). Pro vsehchlenov provádí echokardiografie, biopsiyamiokarda, DCM identifikovat charakteristické znaky (fokální interstitsialnyyfibroz a hypertrofie kardiomyocytů). Pro detekci genových mutací aktin byla použita PCR. dvě jediné mutatsiietogo gen identifikován: jeden - v kardioaktina genu 5. exonu (nahrazující guaninana adenin, což vede ke kódující syntézu histidinu v 312 mpolozhenii namísto argininu) a druhý - na 6. exonu (výměna adeninana guanin, což objevil syntézu 361-poloze glutamin glitsinavmesto). Ale mohl by tyto změny považovat za vramkah kardioaktina polymorfismus genu. Chcete-li vyloučit takové predpolozheniyaprotestirovany 435 nepříbuzných lidí popsanou mutaci nebyl vyyavlenou je. Z tohoto důvodu jsou tato provedení assotsiiruyutsyaimenno aktinového genu s idiopatickou dilatační kardiomyopatie.
Skutečnost, že naše práce nemohly být detekovány mutatsiyagenov aktin a dystrofin není přímým prohlášení, že mutace ne. Možná, že mutace se vyskytuje vbolee pozdějších stádiích nemoci? Je třeba poznamenat, že v nashemissledovanii neprovádí genetickou analýzu v rodinách s idiopaticheskoyDKMP a nepříbuzných lidí byly odebrány. Pravděpodobně glubokihvyvodov také potřebují velkou populaci z hlediska issledovanie.I nesmí být menší významné studie geny drugihstrukturnyh složky srdečního svalu, zejména kollagenai elastinu mutací, které mohou mít také hodnotu v razvitiiHSN.

Reference:
1. Tereschenko SN Clinicopathogenetic genetické aspekty chronickým srdečním selháním ivozmozhnosti korekce drog. / Diss. ... Dr. med. nauk.- M. 1998- 287.
2. Bristow M. R. Proč myokardu selhání? Vysvětlení od základního výzkumu. // Lancet 1998- 352: 8-14.
3. Ortiz-Lopez R., Li H. Su J., Goytia V., Towbin J.A. Důkaz pro dystrofin missensemutation jako příčina X-vázanou dilatační kardiomyopatie. // Circulation1997- 95: 2434-40.
4. Muntoni F. Cau M., Ganau A., Congiu R., Arvedi G. Mateddu A., Marrosu M. G., Cianchetti C, Realdi G. Cao A., Melis M.A. Stručná zpráva: delece dystrofinového svalů promoterregion spojené s X-vázanou dilatační kardiomyopatie. // N.Engl. J. Med 1993- 329: 921-5.
5. Milasín J., Muntoni F., Severini GM, BartoloniL., Vatta M., Kraoinovic M., Mateddu A., Angelini C, CameriniF., Falaschiho A., Mestroni L., Giacca M. a HMD Study Group , Nejaky_bod mutace v 5` místě sestřihu v genu pro dystrofin firstintron zodpovědný za X-vázaná rozšířený cardiomyopathy.// Hum.Mol. Genet. 1996- 5: 73-9.
6. Olson T. M., Michels V.V., Thibodeau S. N., Tai Y.S., Keating M.T. Aktin mutace v dilatační kardiomyopatie, dědičná forma srdečního selhání. // Science. 1998- 280: 750-2.
7. Bies R. D., Maeda M., Roberds S. L., HolderE., Bohlmeyer T. Young J. B., Campbell K.P. 5` dystrofin duplicationmutation způsobuje nedostatek membránu alfa-dystroglykanu v afamily s X-vázanou kardiomyopatie. // J. Mol. Cell. Cardiol.1997- 29: 3175-88.
8. Franz W. M., Cremer M., Herrmann R., GrunigE., Fogel W., Scheffold T., Goebel H. H., Kircheisen R., KublerW., Voit T. a kol. X-vázaná dilatační kardiomyopatie. Novel mutationof dystrofinového genu. // Ann NY Acad. Sci. 1995- 752: 470-91.