Polarizace metody fluorescenční protilátky. Korelace imunoglobulinu

Řešit otázku existence nezávislého otáčení podjednotek imunoglobulinů Velkou pomoc byla metoda fluorescenční polarizace. Základní přístup, který byl použit v těchto pokusech pro studium imunoglobulinů pružnosti spočívala v porovnání experimentálně stanovené časové synchronizace imunoglobulinových molekul, který se nachází v experimentu charakterizující časový molekulu roviny polarizovaného světla, s dobou korelace vypočtené na základě předpokladu, že tuhost molekuly.

Takže, pokud budeme předpokládat, že molekula IgG tuhé elipsoid rotační osy s poměrem 1: 2 a molekulovou hmotností 150.000, doba korelace molekuly musí být roven 73 ns, a experimentálně pozorováno, že byla obecně mnohem nižší: 20-40 ns. To ukazuje na schopnost fragmentů na nezávislou relativní pohyb, a tedy i pružné spojovací částí polypeptidové řetězce. Podobná data byla získána spin štítky.

Vytrvalec a Griffith (Stryer, Griffith, 1965) pro stanovení doby korelační spin značené haptenem navázaného na protilátku, studium chování hmoty, který obsahuje jak skupinu fluorochromu, spinovou značku a odlišný viskózních roztoků.

Změnou viskozity řešení přidáním glycerolu, dosáhla svého EPR spektra odpovídá spektru spin-značené haptenem vázané na aktivní místo. Dále, způsob fluorescenční polarizace je určena dobou korelace. Tak bylo zjištěno, nalezeno korelace času N-O skupina spojená spin-značený hapten být 12 ns. Autoři správně na vědomí, že tato hodnota může být příliš nízká ve srovnání s korelací časového Fab-fragmentu, protože nelze vyloučit možnost otáčení kruhu vzhledem imminoksilyyugo dinitrofenyl skupiny, pevně spojen s aktivním centru. Tato nevýhoda je společná pro všechny pokusy pro stanovení doby korelační IgG Fab-fragmentu pomocí spin-značené hapten.

">

Hsia a Piette (Hsia, Piette, 1969) pro určení časové synchronizace spojené s aktivním centru spin-značený hapten, kalibrační závislosti na viskozitě EPR spektra roztoku spin etiket. Doba korelace, odpovídající konkrétní rozsah, určené Stokesova zákona - Einstein, zvažuje, že účinná Stokesův poloměr ochranné známky je 5 A. Nejkratší spin-značený hapten nejvíce pevně váže na aktivní místo, měl čas korelace 39 ns.

Dweck et al (Dwek e. a., 1975a), vypočtená doba korelace spin-značeného DNP lokalizovány v aktivních center IgA (MOPC 315) a FAB a Fv-fragmsntov. Bylo zjištěno, že 44,4, 23 a 6,5 ​​ns, v tomto pořadí.

získány králičí protilátky přímo proti spin etiket 2,2,6,6-tetramethylpiperidin-4-amino (N-dichlortriazinu) sloužil imunizací s haptenem. Výsledkem tvorby specifických komplexů protilátky a peptické fragmenty papannovyh s spin štítek má svou silnou imobilizaci. Míchání příslušného množství roztoků nespecifické IgG a etikety podobných podmínek bylo pouze ve vzhledu EPR spektra volného značení. korelace času Štítky vypočítané Shimshiku a McConnel (Shimshick, McConnell, 1972). bylo zjištěno, že 32, 30 a 18 ns, respektive pro komplexy spinové značky s protilátkou, Fc- a Fab-fragmenty izoelektrického bodu (pH 6,3).
Získané hodnoty času korelace IgG na Fab fragmentů a potvrzeno v citovaném dokumentu.

Rozdíly v čase korelace, získané pro Fab-fratmenta jako izolován a je součástí F (ab) 2 a intaktní protilátka označují omezení volného otáčení Fab fragmentů, podjednotek uložená reakcí F (ab) 2 a IgG. Zvýšení teploty vede ke snížení snížené standardních podmínek (3 * 105 P / ° C), čas korelace označí komplexy s F (ab) 2 a IgG.

Zdá se, že při zahřívání svoboda Relativně jim v pohybu zvyšuje podjednotky. Možnost získání protilátek na spinovou značku, sloužil imunizací s haptenem je potvrzeno v jiné studii (Humphries, McConnell, 1976).