Faktor Leiden

Jak bylo uvedeno výše, gen abnormalita z koagulačního faktoru V, G 1691>A byl objeven v roce 1994 R. Bertina et al. Jediný nukleotidu substituce guaninu na adenin v poloze 1691 (1691 G>A) v exonu 10 genu F5 způsobuje molekulární defekt koagulačního faktoru V. Protože výměna v poloze 506 molekuly proaktselerina argininu na glutamin (Arg506Gln) narušen jeho schopnost ke zhroucení, což má za následek vznik dysfunkce systému C antikoagulačního proteinu a s tendencí k recidivám trombózy. Genetické abnormality koagulačního faktoru V (Leiden) je nejčastější trombofilní defekt v evropské populaci.

Pro detekci genetických abnormalit provedení s použitím PCR. Vysoká citlivost a specifičnost PCR poskytují v oligonukleotidů in vitro syntetizuje komplementární k odpovídající oblasti genu lidského koagulačního faktoru V.

Nedostatek jednotné klasifikace genetických vad způsobilo rozšířené v současné vědecké literatuře četné příznaky této anomálie: F5: 1691 G>A, Rs6025, Arg506Gln, G1691A, R506Q, Leiden (leydenovskaya) a další.

Principem metody

Pro identifikaci polymorfních alel v amplifikace genu F5 použitím příslušných částí genu pomocí PCR s následným stanovením amplifikačních produktů.

Reakční činidla a zařízení

• Kontrolní vzorky s divokou alelu a mutantní alely.
• Pro určení anomálie F5 1691 G>Bylo použito dva primery. Primer 1 (dopředný primer): ACGTTGGATGC TGAAAGGTTACTTCAAGGAC, Primer 2 (reverzní primer): ACGTTGGATGCTCTGGGCTAATAGGACTAC.
• Zesilovače a jiná zařízení k provádění PCR.

Vzorky krve pro studie pro výzkum materiálu může být jakýkoliv zdroj DNA, ale žilní krev je používán, který se do zkumavek obsahujících EDTA. Vzorky byly uloženy před zahájením studie, při teplotě 2 ... + 8 ° C po dobu až 24 hodin. Long uložené vzorky mohou být pouze ve zmrazeném stavu při teplotě -40 ° C ... 70

Izolace DNA z klinických vzorků materiálu se může provádět různými způsoby, například pomocí soupravy na bázi oxidu křemičitého, nastaví mikroodstředivce sloupce sady založené na extrakci fenol-chloroformem, a další.

Metody stanovení

Metoda je založena na oblasti vícenásobné kopírování volební DNA s použitím in vitro enzymu. Pokrok ve studii musí splňovat vybraná zařízení a postup analýzy PCR (gelová elektroforéza, blesk a podobně.).

VIDEO: Nizozemsko, Noord-Holland. Part1. 06-2011

Vyhodnocení výsledků studie

Vyhodnocení výsledků se provádí tak, aby díky polymorfní oligonukleotid domova výměnu. Příklad vizualizaci výsledků amplifikace je znázorněno na obr. 5.1.

Video: všechna města a země světa na jednom místě

Provedení leydenovskoy anomálie výsledky detekce z genových koagulačního faktoru následující: G / A - heterozygotní anomálie formuláře v poloze 1691- A / A - homozygotní anomálii. Populace převažuje genotyp G / G.

Interpretace výsledků průzkumu

Nosičů leydenovskoy F5 genové abnormality jsou náchylné k trombóze, což výrazně zvyšuje riziko v těhotenství, používání orální antikoncepce, v pooperačním období, a další. Gene penetrace je neúplná, tedy počet nosičů nemá historii trombotických poruch. V tomto provedení je přítomnost homozygotní mutace četnosti a závažnosti trombózy výše. Detekce heterozygotní frekvence anomálií, podle literatury, je v populaci asi 1-3%.

Substituce aminokyseliny v poloze 506 poskytuje místo štěpení molekuly koagulačního faktoru V, aktivovaný protein C, což výrazně snižuje rychlost jeho degradaci. Proto je přítomnost genu anomálie F5 G 1691>Odpor pozorovány koagulační faktor Va podle aktivovaný protein C.

Detekce této mutace u pacientů s rekurentní trombózou umožňuje ospravedlnit prodloužené antikoagulační profylaxe. Tato studie může pomoci identifikovat jedince, kteří potřebují, aby rozhodly o použití antikoagulancií při provádění operací.

Video: Dr. Elena Berezovskaya - Thrombophilia a těhotenství

Příčiny chyb

• Chyby pre-analytické fáze studie (v rozporu době skladování nebo způsob dopravy biomateriálů nukleových kyselin lze rozebrat, což způsobuje falešně negativní na výsledky heparinu je schopný inhibovat PCR, takže krevní vzorky nesmí být provedena ve zkumavkách obsahujících heparin).
• Kontaminace vzorků cizí biologický materiál.
• Porušení zásad územního laboratoře pro molekulárně genetických studií.
• Odmítnutí studovat negativní kontrolu.
• Odmítnutí provést opětovnou analýzu pozitivních vzorků.
• Selhání izolace DNA technik.
• Specifičnost a citlivost PCR primerů závisí zejména na struktuře, takže použití primerů od různých výrobců, může způsobit, že se získáním odlišné výsledky.

Další analytické techniky

PCR varianty bylo zjištěno, že spolehlivé laboratorní postupy, které jsou schopné zajistit vysokou citlivost, specifitu a reprodukovatelnost. Ve většině případů trombofilických pro diagnostiku onemocnění, při kterém poruchou proaktselerina inaktivaci mohou být použity způsobem koagulační stanovení rezistence na aktivovaný protein C. Poznámka, nicméně, že jiné poruchy (hyperproduction Antihemophilic globulin, VA a kol.) Jsou také schopny indukovat rezistenci koagulace faktoru V na aktivovaný protein C